葛 雷，曲曉偉，胡建庭，單中杰，韓前河，楊慶祥，翟曉磊，趙 陽

(鄭州人民醫(yī)院，鄭州450003)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤，尤以移行細胞癌為多見，其發(fā)病機制仍不十分明確［1］。有研究表明細胞周期分布的改變與細胞癌變密切相關(guān)，許多癌基因、抑癌基因參與了細胞周期的調(diào)控。p57kip2作為候選抑癌基因，其表達與大腸癌、上皮性卵巢癌、肝癌、甲狀腺癌、肝外膽管癌及肝內(nèi)膽管癌等發(fā)病機制關(guān)系密切［2］，而與膀胱癌的關(guān)系報道仍較少。2011年8月～2012年4月，我們檢測并比較了26例膀胱移行細胞癌組織和19例癌旁正常組織中的p57kip2mRNA?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集鄭州人民醫(yī)院26例原發(fā)性膀胱移行細胞癌患者手術(shù)切除的新鮮組織標本，為觀察組。26例患者中男18例，女8例;年齡28～78歲，平均62.6歲。在遴選病例時將有酗酒和過量吸煙(＞20支/d)等不良嗜好者及化工制造從事業(yè)者等膀胱癌高危人群剔除。另取19例癌旁正常組織標本為對照組。

1.2 p57kip2mRNA檢測方法 將組織研碎，按50～100 mg/mL標準加入Trizol，冰上放置5 min;然后加入200 μL氯仿，快速震蕩15 s，冰上放置10 min后，4℃、15 000 r/min離心15 min;仔細吸取上層水相，移至另一支EP管中;加入等體積(約500 μL)異丙醇，冰上放置10 min;4℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清，加入75%乙醇(焦碳酸二乙酯處理滅菌水配制)500 μL，充分洗滌沉淀物;4℃、10 000 r/min離心5 min后棄上清，室溫干燥3 min，DEPC處理滅菌純水20 mL溶解RNA沉淀;分光光度計測定總RNA產(chǎn)物量及純度，提取的RNA置于－80℃冰箱凍存。參照文獻設計引物［1，2］。PCR反應條件: 95℃變性5 min，然后按95℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃60 s，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

制備2%的瓊脂糖凝膠，含溴化乙錠0.5 μg/ mL。取PCR擴增產(chǎn)物5 μL與上樣緩沖液1 μL混勻，加入加樣孔。電泳緩沖液為0.5×TBE。電泳條件為80 V電壓，45 min。在β-actin同時擴增出來的前提下，擴增產(chǎn)物在紫外燈下呈明亮的橙色熒光，其所處的位置與該目的基因片段長度相符，即為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。組間比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

觀察組26例(38.45%)、對照組19例(100%) p57kip2mRNA表達陽性，兩組p57kip2mRNA陽性表達率相比，P＜0.05。

3 討論

膀胱癌在我國泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中占首位，以移行細胞癌為主。盡管人們已經(jīng)對膀胱癌的病因、病理、診斷和治療等進行了深入的研究，但其發(fā)病機制仍不十分明確。膀胱癌的發(fā)生是一個多因素、多步驟、復雜的漸進過程，其病程的發(fā)展和演進也同樣涉及多個抑癌基因的失活和(或)癌基因的激活。研究表明細胞周期與細胞癌變密切相關(guān)，許多癌基因、抑癌基因參與了細胞周期的調(diào)控，或者其本身就是細胞周期的組成部分，它們的改變導致了細胞周期的失控，表現(xiàn)為細胞的失控性生長，

p57kip2基因定位于染色體 11p15.5上的D11S648和Dl1S679之間約2.2 kb的區(qū)域內(nèi)［3，4］，屬CIP/KIP家族，與 p21、p27功能相似，通過與CDK結(jié)合而抑制CDK的功能使細胞周期停滯在G1期。Lee等［4］認為p57kip2作為候選抑癌基因，其抑癌機制可能是p57kip2蛋白與Cyclin-CDK復合物相結(jié)合，阻止細胞增殖，從而使細胞周期停滯在G1期。Kondo等［5］認為正常情況下，p57kip2基因為父源等位基因被印記，母源基因表達，在一些腫瘤中存在p57kip2基因印記缺失或印記錯誤，導致基因表達下降。關(guān)于p57kip2蛋白在腫瘤組織中表達的研究多集中在大腸癌、上皮性卵巢癌、肝癌、甲狀腺癌、肝外膽管癌及肝內(nèi)膽管癌等。而有關(guān)p57kip2表達與膀胱癌關(guān)系報道較少。Nakai等［6］研究發(fā)現(xiàn)，p57kip2蛋白的表達與肝細胞癌的病理組織階段、分化程度及患者的預后有密切關(guān)系，且在中、低度分化的肝細胞癌中，p57kip2基因有明顯的雜合性缺失，可認為p57kip2基因表達下降或缺失是肝細胞癌晚期的表現(xiàn)。Oya等［7］利用RT-PCR技術(shù)檢測24例膀胱移行細胞癌和14個膀胱癌細胞株，發(fā)現(xiàn)其中p57kip2達顯著下降，其中部分p57kip2表達缺失，說明p57kip2是一種在膀胱癌中影響母系染色體11p15.5的重要靶基因。本研究結(jié)果顯示膀胱移行細胞癌組織中p57kip2的陽性表達率要明顯低于癌旁正常組織，提示 p57kip2異常低表達與膀胱癌發(fā)病密切相關(guān)。理論上，作為一種細胞周期負性調(diào)控因子，應在正常組織中表達，而在腫瘤組織中會受到抑制而表達減少或表達缺失，導致細胞生長失控而惡變［8，9］。但是正性調(diào)控因子增加后，為達到細胞周期調(diào)控的平衡，可反饋性的引起負性調(diào)控因子的增高，直至腫瘤發(fā)生并惡化后這一平衡才被打破，負性調(diào)控因子的表達因而下降。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)p57kip2mRNA及蛋白表達與腫瘤的高臨床分期和預后有極大關(guān)系，說明p57kip2基因的失活在膀胱癌的進展中起著一定的作用，并可能是一個新的預后指標，這與文獻報道的一致［7～9］。關(guān)于 p57kip2基因在膀胱癌失活的具體機制，還需要進一步研究［10，11］。

［1］Tannapfel A，Busse C，Weinans L，et al.INK4a-ARF alterations and p53 mutations in hepatocellular carcinomas［J］.Oncogene，2001，20(48):7104-7109.

［2］Li Y，Nagai H，Ohno T，et al.Aberrant DNA methylation of p57 (KIP2)gene in the promoter region in lymphoid malignancies of B-cell phenotype［J］.Blood，2002，100(7):2572-2577.

［3］Matsuoka S，Edwards MC，Bai C，et al.p57kip2，a structurally distinct member of the p21CIP1 Cdk inhibitor family，is a candidate tumor suppressor gene［J］.Genes Dev，1995，9(6):650-662.

［4］Lee MH，Reynisdottir I，Massague J.Cloning of p57kip2，a cyclindependent kinase inhibitor with unique domain structure and tissue distribution［J］.Genes Dev，1995，9(6):639-649.

［5］Kondo M，Matsuka S，Vchida K，et al.Selective maternal allele loss in human lung cancers of the maternally expressed p57kip2gene at 11p15.5［J］.Oncogene，1996，12(6):1365-1368.

［6］Nakai S，Masaki T，Shiratori Y，et al.Expression of p57(KIP2) in hepatocellular carcinoma:relationship between tumor differentiation and patient survival［J］.Int J Oncol，2002，20(4):769-775.

［7］Oya M，Schulz WA.Decreased expression of p57(KIP2)mRNA in human bladder cancer［J］.Br J Cancer，2000，83(5):626-631.

［8］Shin JY，Kim HS，Lee KS，et al.Mutation and expression of the p27KIP1 and p57kip2genes in human gastric cancer［J］.Exp Mol Med，2000，32(2):79-83.

［9］Ito Y，Takeda T，Sakon M，et al.Expression of p57/Kip2 protein in hepatocellular carcinoma［J］.Oncology，2001，61(3):221-225.

［10］Uchida T，Kinoshita T，Ohno T，et al.Hypermethylation of p16INK4A gene promoter during the progression of plasma cell dyscrasia［J］.Leukemia，2001，15(1):157-165.

［11］Shin JY，Kim HS，Lee KS，et al.Mutation and expression of the p27KIP1 and p57KIP2 genes in human gastric cancer［J］.Exp Mol Med，2000，32(2):79-83.