王清靜 張 恒 龍民慧 王 蕾 張金鳳

小腸黏膜上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IEC)是腸道內(nèi)重要的功能細(xì)胞，在營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及消化酶分泌、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等方面都發(fā)揮著重要作用，并與腸道的內(nèi)、外分泌功能有密切關(guān)系。小腸黏膜上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)已成為研究腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收、利用及轉(zhuǎn)化，細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及腸道免疫屏障功能的主要手段之一[1]，為研究小腸上皮細(xì)胞相關(guān)的生物學(xué)功能提供了理想的試驗?zāi)Ｐ?。本文簡述了小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)的有關(guān)方法及在動物營養(yǎng)上的研究進(jìn)展。

1 小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)

1.1 原材料的選擇

體外培養(yǎng)小腸上皮細(xì)胞對原材料的要求非常嚴(yán)格，多取材于增殖能力強(qiáng)、污染少的胚胎或新生動物，因其小腸黏膜組織稚嫩、結(jié)構(gòu)疏松容易分離培養(yǎng)?？飩?2007)[2]用新生白山羊的十二指腸組織，進(jìn)行小腸上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，成功建株。馬玉龍等(2007)[3]以18日齡雞胚的腸組織為原材料，消化后收集小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)研究，獲得了大量細(xì)胞團(tuán)。成體腸黏膜上皮細(xì)胞很少用于培養(yǎng)，因其在體外培養(yǎng)幾天后會凋亡，穩(wěn)定傳代極為困難，難以構(gòu)建長期存活的細(xì)胞試驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1.2 小腸上皮細(xì)胞的分離

1.2.1 機(jī)械破碎法

先用磷酸鹽緩沖液(PBS)和無血清的DMEM培養(yǎng)液清洗小腸組織，然后將其剪成＜1 mm3的碎片，培養(yǎng)數(shù)天，組織塊周圍即可輻射生長出大量的單層細(xì)胞，主要是上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。該方法簡單易操作，獲得的細(xì)胞活性和增殖能力較強(qiáng)，但成纖維細(xì)胞污染嚴(yán)重，需進(jìn)一步從中挑選出上皮細(xì)胞進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 酶學(xué)消化法

酶學(xué)消化法是利用化學(xué)的方法去掉組織中的細(xì)胞間質(zhì)，使其分散成單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞本身不受傷害。常用的酶有胰蛋白酶、膠原酶、中性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等。

1.2.2.1 胰蛋白酶(Parenzyme)

該酶是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中由賴氨酸和精氨酸構(gòu)成的羧基側(cè)切斷，使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，細(xì)胞離散，是特異性最強(qiáng)的蛋白酶。但因消化能力較強(qiáng)，常常會損壞細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞的貼壁率很低。廖賢平等(1998)[4]用胰蛋白酶消化組織塊，培養(yǎng)人類小腸上皮細(xì)胞，得到的細(xì)胞大部分為單細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)塊，貼壁和生長能力較差。

1.2.2.2 膠原酶(Collagenase)

一般是從芽孢桿菌中提取制備，主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，對細(xì)胞間質(zhì)有消化作用，而對上皮細(xì)胞影響不大。當(dāng)消化的組織較硬，內(nèi)含較多結(jié)締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細(xì)胞的效果會較差，采用膠原酶解離細(xì)胞法就可以取得很好的效果。馬玉龍等(2007)[3]分別采用1 g/l膠原酶Ⅰ和1 000 U/ml膠原酶Ⅺ消化分離雞胚腸上皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1 g/l膠原酶I消化70 min后所獲得的多為細(xì)胞團(tuán)、少量腸隱窩器官樣細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞，細(xì)胞貼壁好，生長良好。膠原酶主要水解細(xì)胞間質(zhì)的脯氨酸多肽離散細(xì)胞，其消化的是細(xì)胞間質(zhì)而不是細(xì)胞表面，因此不會損傷細(xì)胞膜，不會影響細(xì)胞的存活率及貼壁率，但由于個體差異，探索最佳消化時間和濃度需要較長的時間。

1.2.2.3 噬熱菌蛋白酶(Thermolysin)

主要水解非極性氨基酸的氨基端肽鍵，可用來從真皮中分離角質(zhì)細(xì)胞，用噬熱菌蛋白酶來分離消化小腸上皮細(xì)胞的最大優(yōu)點是保持了上皮細(xì)胞的活性和增殖能力。張道杰等(2004)[5]用嗜熱菌蛋白酶消化分離人的胎兒腸上皮細(xì)胞，接種于DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，純化后，成功地進(jìn)行了傳代與鑒定。噬熱菌蛋白酶能分離較多的健全絨毛隱窩單位，而健全絨毛隱窩單位分離是維持IEC體外生長繁殖的一個關(guān)鍵因素[6]，培養(yǎng)的IEC較純，但是增殖緩慢。聯(lián)合使用噬熱菌蛋白酶和膠原酶Ⅰ可分離出較純的上皮細(xì)胞，缺點是分裂數(shù)次后便停止分裂。

1.2.2.4 其他

與使用單種酶相比，使用復(fù)合酶有時可以取得更好的效果。復(fù)合酶可降低消化酶的濃度，減輕酶對細(xì)胞的損害毒性，縮短消化時間。馬玉龍等(2007)[3]使用多種酶分離18日齡雞胚腸上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)低濃度的膠原酶Ⅺ型和中性蛋白酶Ⅰ型聯(lián)合作用35 min，得到大量腸隱窩器官樣細(xì)胞團(tuán)、部分細(xì)胞團(tuán)和少量單細(xì)胞，細(xì)胞貼壁能力較強(qiáng)，生長良好，而單獨使用0.5 g/l中性蛋白酶消化70 min后所收獲的多為細(xì)胞團(tuán)、少量腸隱窩器官樣細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞；細(xì)胞能貼壁，但生長不良。王海霞等(2007)[7]使用多種酶分離新生徐淮白山羊羔羊小腸上皮細(xì)胞，也發(fā)現(xiàn)膠原酶Ⅺ和中性蛋白酶I分離30 min后即可見大量絨毛隱窩單位，l～2 d絨毛隱窩單位貼壁，開始“長出”梭狀細(xì)胞，并向周圍蔓延，長出的細(xì)胞大部分是小腸上皮細(xì)胞。

1.2.3 非酶學(xué)消化法

EDTA(乙二胺四乙酸)是常用的非酶性消化物，通過螯合溶液中的二價陽離子破壞細(xì)胞緊密連接以達(dá)到消化效果，其作用溫和，多用于解離單層細(xì)胞。Pedersen等(2000)[8]分離人類結(jié)腸上皮細(xì)胞，用EDTA和EGTA分別處理10 min和60 min，結(jié)果表明，10 min即可獲得完整的隱窩細(xì)胞，細(xì)胞活力優(yōu)于處理60 min獲得的上皮細(xì)胞，其純度也高于酶消化法。EDTA對細(xì)胞的毒性主要取決于摩爾濃度、溫度和作用時間。當(dāng)摩爾濃度大于10 mmol/l時，EDTA對細(xì)胞產(chǎn)生的毒性較強(qiáng)[9]。其原因是EDTA和EGTA作用較緩和，單獨消化新鮮組織時很少使用，一般結(jié)合其他酶聯(lián)合使用。

1.3 純化

純化是一個去除異源細(xì)胞的過程。少量的異源細(xì)胞對IEC的生長繁殖有利，但過度繁殖卻會起抑制作用[10]。一般的純化主要是去除成纖維細(xì)胞，常用的方法有機(jī)械刮除法、相差消化法和相差貼壁法。

1.3.1 機(jī)械刮除法

當(dāng)上皮細(xì)胞被大量集中的成纖維細(xì)胞包圍生長時，常用該方法除去成纖維細(xì)胞的污染。具體方法是：在顯微鏡下，用記號筆將培養(yǎng)皿中上皮細(xì)胞的集落區(qū)域勾畫出來，用刮子或滅過菌的槍頭直接將棄去的細(xì)胞區(qū)域刮除，用培養(yǎng)液或PBS洗滌后，將上皮細(xì)胞用酶消化下來，在新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，必要時可重復(fù)上述刮除過程，即可達(dá)到純化目的。刮除法效果明顯，但常對細(xì)胞造成一定的機(jī)械損傷，因此，應(yīng)將上皮細(xì)胞區(qū)域適當(dāng)畫大，且要注意在超凈工作臺上操作，防止污染。

1.3.2 相差消化法

上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞夾雜生長時，可用相差消化法純化。由于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對酶的耐受性不同，可用膠原酶處理一次后在顯微鏡下觀察，成纖維細(xì)胞先被消化下來，吸去上部培養(yǎng)液，用PBS洗滌后再次用酶消化，此時消化下來的細(xì)胞大部分是小腸上皮細(xì)胞。

1.3.3 相差貼壁法

相差貼壁法是基于成纖維細(xì)胞比上皮細(xì)胞貼壁快的特點來分離兩類細(xì)胞以達(dá)到純化的目的。具體方法是將細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)5～10 min后，吸出全部培養(yǎng)液，再接種到第二個培養(yǎng)瓶中。如有必要，可反復(fù)多次，至小腸上皮細(xì)胞純化為止[9]。也可將細(xì)胞在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育2 h后，小心移除未貼壁生長的異源細(xì)胞[11]。

此外還有克隆板克隆法、克隆環(huán)分離法、3T3細(xì)胞飼養(yǎng)層法[9]等方法，具體實驗中應(yīng)靈活選用各種方法，以達(dá)到純化的目的。

1.4 細(xì)胞系的建立

分離純化后的上皮細(xì)胞生長到相互匯合時開始傳代：先用PBS清洗貼壁的細(xì)胞，然后加入rypsin-EDTA消化液，使細(xì)胞與瓶壁分離并相互散開，當(dāng)細(xì)胞回縮呈圓形時，迅速用含有血清的培養(yǎng)基 (FBSDMEM/F12)終止消化，離心，棄去上清液，用血清培養(yǎng)基重新吹打懸浮細(xì)胞，計數(shù)，移植到新的培養(yǎng)瓶中增殖，完成細(xì)胞系建立。

1.5 IEC的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)檢查

福爾馬林固定小腸組織，HE染色后，在倒置顯微鏡下，常規(guī)觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和形態(tài)特征，拍照記錄后與現(xiàn)有的小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行對比。正常的仔豬小腸上皮細(xì)胞由單層立方形細(xì)胞及扁平多角狀細(xì)胞構(gòu)成，胞質(zhì)比較豐富，核為圓形或者橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)稀疏空亮，核仁 1～2 個[12]。

1.5.2 免疫組織化學(xué)檢測

免疫組織化學(xué)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。腸上皮細(xì)胞可產(chǎn)生特有的表達(dá)產(chǎn)物細(xì)胞角蛋白[1]，對細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，通過結(jié)果的陽性和陰性，可進(jìn)一步鑒定小腸上皮細(xì)胞。

1.5.3 電鏡法

細(xì)胞橋粒和刷狀緣是上皮細(xì)胞典型的結(jié)構(gòu)特征，通過電子顯微鏡掃描觀察可鑒定上皮細(xì)胞。先用戊二醛固定，乙醇脫水，乙腈干燥，制得標(biāo)本后觀察鑒定。

2 小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)在動物研究中的應(yīng)用

2.1 豬

小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立，為研究豬腸道營養(yǎng)的消化吸收、免疫屏障、腸道病毒性及細(xì)菌性疾病提供了便利。王靜等(2010)[12]使用多種酶消化法分離腸上皮細(xì)胞，利用組織塊培養(yǎng)法成功建立了能夠連續(xù)傳代的新生仔豬小腸上皮細(xì)胞株，獲得的細(xì)胞活力較好，增殖能力較強(qiáng)，為研究豬的腸道生理提供了可靠的試驗?zāi)Ｐ汀ｊ愃紤训?2008)[13]研究了氟對體外小腸上皮細(xì)胞的影響，研究表明，當(dāng)氟添加量＜10.0 μg/ml時，細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶活性無明顯改變；而高氟組(20.0 μg/ml)小腸上皮細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶活性受到顯著抑制，并且小腸上皮細(xì)胞的形態(tài)由多角形變?yōu)閳A形，細(xì)胞核溶解，大部分細(xì)胞死亡，為進(jìn)一步研究氟對體外小腸上皮細(xì)胞的危害機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

2.2 牛和羊

葡萄糖和谷氨酰胺(Glutamine，Gln)是腸道黏膜細(xì)胞代謝的能源物質(zhì)，當(dāng)動物處于疾病等應(yīng)激狀態(tài)時，腸道對葡萄糖的攝取明顯下降，對Gln的利用顯著增加，即應(yīng)激小腸能量代謝對Gln具有依賴性，同時Gln是細(xì)胞分化增殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。周玉香等(2009)[14]對早期斷奶犢牛小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行分離和體外培養(yǎng)，研究Gln和葡萄糖對早期斷奶犢牛小腸上皮細(xì)胞能量利用的影響。結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)液中加入血液水平2倍的Gln，有利于早期斷奶犢牛小腸上皮細(xì)胞生長，促進(jìn)三磷酸腺苷(ATP)的合成和能量儲備，為保護(hù)犢牛腸道健康提供理論依據(jù)。彭春燕等(2010)[15]通過培養(yǎng)山羊小腸上皮細(xì)胞研究氨基酸的代謝利用狀況，結(jié)果表明，組氨酸、精氨酸、蘇氨酸和亮氨酸是小腸上皮細(xì)胞快速利用的氨基酸，其含量在72 h內(nèi)快速下降；天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸是生成的氨基酸，在72 h內(nèi)有所積累；其它氨基酸呈現(xiàn)平緩的被消耗狀態(tài)。

2.3 家禽

小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在雞和鵝上也已成功建立，家禽腸液的pH值范圍為7.39～7.53，培養(yǎng)基的pH值最好控制在此范圍內(nèi)[16]。生長因子對于細(xì)胞的增殖分化具有十分重要的作用，在培養(yǎng)液中添加胰島素、胰島素樣生長因子和表皮生長因子可有效促進(jìn)IEC的增殖。楊文平等(2007)[17]培養(yǎng)1月齡三黃雞IEC發(fā)現(xiàn)，配合使用胰蛋白酶EDTA，可獲得大量的健全腸絨毛隱窩單位。通過組織塊種植法和酶消化法進(jìn)行原代鵝小腸上皮的體外培養(yǎng)的比較。李融等 (2009)[18]發(fā)現(xiàn)，組織塊種植法得到的鵝小腸上皮細(xì)胞生長狀況良好，活性強(qiáng)、純度高，為腸道細(xì)胞的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

3 展望

細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)是分子生物學(xué)的一項重要技術(shù)，該技術(shù)與多種現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于生命科學(xué)的各個研究領(lǐng)域。體外試驗相對于體內(nèi)試驗，具有簡化細(xì)胞生長環(huán)境、節(jié)省飼養(yǎng)動物的成本、明確細(xì)胞生長條件、便于施加各種試驗因素、可直接觀測結(jié)果及方便控制培養(yǎng)產(chǎn)物等優(yōu)點，應(yīng)用越來越廣泛。但目前，研究主要集中于鼠或人的腸上皮細(xì)胞系，僅局限于人類生物制藥方面，而為人類提供肉、蛋、奶等畜禽類的動物細(xì)胞營養(yǎng)方面的研究報道較少，因此，小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)在動物營養(yǎng)上的應(yīng)用有很大的發(fā)展空間。

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