馬 丹 高麗娜 陳永平 李春青

17α-甲基睪丸酮 (17α-methyltestosterone,MT，見圖1)是一種人工合成的雄激素類藥物，具有增強雄性體性特征和蛋白同化雙重作用，從小喂食可以改變魚體的性別，多年來廣泛施用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的苗種培育和性別控制等方面。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，單性養(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)具有魚體成活率高、產(chǎn)量高、成本消耗低、質(zhì)量優(yōu)等特點，而雄性是單性魚體養(yǎng)殖中的最佳性別，無論在飼養(yǎng)周期、個體大小、色澤體型等方面都優(yōu)于雌性魚體，所以在魚飼料中摻入17α-甲基睪丸酮，是最快捷方便有效的雄性化魚苗的方法。應(yīng)用中最常見的養(yǎng)殖魚類就是產(chǎn)量居世界排名第二的羅非魚，隨著應(yīng)用技術(shù)的成熟，也廣泛應(yīng)用于對蝦類、蛙類、甲魚等養(yǎng)殖水產(chǎn)品中。但是17α-甲基睪丸酮作為雄性激素添加于飼料中被動物攝入，如果一味追求養(yǎng)殖動物的成熟時間而在魚體內(nèi)并未消解完全，被人類食用而進(jìn)入人體，即使微小的含量，作為雄性激素也會對人類的健康產(chǎn)生不利的影響，會擾亂人體內(nèi)激素平衡，引起婦女出現(xiàn)類似早孕的反應(yīng)及乳房腫脹、不規(guī)則出血等，影響肝臟功能，導(dǎo)致新生兒畸形、溶血及黃疸等，對成人也有致癌作用。由于甲基睪丸酮有著巨大的潛在危害，歐盟95/22/EC規(guī)定禁止使用雄性激素獸藥，美國也規(guī)定其同類的丙酸睪酮在肌肉中的最大殘留限值(MRLs)為0.64 μg/kg，我國農(nóng)業(yè)部235號公告發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定其為禁止使用獸藥，在所有動物性食品的所有可食組織中不得檢出。

本文旨在建立和優(yōu)化MT在飼料中的檢測方法，利用 3β-methoxy-17β-hydroxyandrost-5-en-7-one[3β-甲基-17β-羥基-5-雄烯-7-酮，見圖1（2）]作為內(nèi)標(biāo)（I.S.），建立了高效液相色譜測定飼料中的17α-甲基睪丸酮方法。此方法在254 nm限定波長的條件下能夠定量分析魚飼料中MT。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Aglient 1200全自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器），電子分析天平XS1050型(METTLER TOLEDO公司)，臺式離心機 3K15型(SIGMA公司)，氮吹儀N-EVPA 112型，旋渦振蕩器G560E型(Scientific Industries.Inc)，固相萃取柱 Oasis-HLB型3cc Waters公司。

1.2 藥品與試劑

17α-甲基睪丸酮(17α-methyltestosterone，純度大于99%)(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司生產(chǎn))，魚飼料，3β-甲基-17β-羥基-5-雄烯-7-酮 (I.S.)(于相關(guān)實驗室合成，245 nm紫外波長下純度＞99.5%)，甲醇、乙醇、正己烷、乙腈、甲酸、乙酸（均為色譜純），純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司生產(chǎn))。

1.3 色譜條件

WatersXterraRP18色譜柱（150mm×4.6 mm×5 μm）；檢測波長 254 nm；流動相水-乙腈(80： 20，V/V)；流速0.5 ml/min；柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量 10 μl。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

MT標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取15.00 mg MT用甲醇定容于100 ml容量瓶中，配置成0.15 mg/ml濃度的MT標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于0～4℃避光儲存，試驗前稀釋至不同濃度制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

內(nèi)標(biāo)溶液：相同方法配置3.0 mg/ml濃度的內(nèi)標(biāo)溶液3β-甲基-17β-羥基-5-雄烯-7-酮，稀釋 10倍，得0.3 mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.5 樣品測定

1.5.1 提取

先將魚飼料樣品粉碎過40目篩，用四分法稱取5 g飼料樣品（精確到0.000 1 g）于50 ml聚丙烯離心管中，與外標(biāo)MT充分混勻，靜置20 min后向離心管中加入3 ml正己烷，渦旋20 s使之混合均勻，然后再依次加入 12 ml甲醇和 0.1 ml內(nèi)標(biāo)溶液（30.0 μg/ml），渦旋兩次，每次20 s，使其充分混勻，靜置后加入3 ml水，重復(fù)渦旋兩次20 s，以5 000 r/min離心10 min，準(zhǔn)確吸取2 ml上層甲醇-水溶液于15 ml聚丙烯離心管中。

1.5.2 凈化

加2 ml正己烷洗滌離心管中提取液，劇烈震蕩渦旋20 s，靜置后除去正己烷層，用氮氣在40℃條件下將甲醇-水層濃縮至0.3 ml左右，加水稀釋至3 ml，將樣液全部移入預(yù)先用2 ml甲醇和2 ml水活化的固相萃取管中深層凈化，先后加入含有2%乙酸的1：1甲醇-水混合液1 ml洗滌兩次，抽干柱中溶液，再用甲醇洗滌兩次，每次加入1 ml，一齊并入15 ml聚丙烯離心管中，再加入稀釋水(4.0±0.1)ml定容到10 ml，以5 000 r/min離心5 min，取0.5 ml清液于2 ml自動進(jìn)樣瓶中，上機分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

首先用甲醇提取魚飼料中的MT，其中包含樣品中的油和脂肪等成分，經(jīng)過正己烷洗滌后可除去溶解于甲醇中80%的油脂，然后將甲醇水層蒸干再加入蒸餾水移于固相萃取進(jìn)一步凈化，以水-乙腈為流動相運用內(nèi)標(biāo)方法測定分析魚飼料中MT的含量。

2.2 方法專屬性

內(nèi)標(biāo)結(jié)構(gòu)式與MT近似，其吸收峰可以清晰地與MT吸收峰區(qū)分開（見圖2），是比較理想的內(nèi)標(biāo)化合物。魚飼料樣品經(jīng)過前處理，提取液不會影響MT及內(nèi)標(biāo)出峰的保留時間，MT和內(nèi)標(biāo)亦不會互相干擾。結(jié)果得出（見圖3、圖4），加標(biāo)樣品中內(nèi)標(biāo)和MT色譜峰的平均保留時間（n=8）分別是8.68 min(R.S.D=0.19%)和11.29 min（R.S.D=0.20%），具有較強專一性。

2.3 線性范圍及定量限

稀釋 MT儲備液分別配置成 7.5、15.0、30.0、45.0和60.0 μg/ml 5個系列濃度的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)液，按照1.3中色譜條件進(jìn)行分析，以樣品與內(nèi)標(biāo)面積比(X)對相應(yīng)的樣品與內(nèi)標(biāo)濃度比(Y)進(jìn)行線性擬合，擬合方程為：Y=1.276 3X+0.031 8，R2=0.999 8，在 7.5～60.0 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。本方法的定性檢出限為1.3 mg/kg（S/N=3），定量檢出限為 3.4 mg/kg（S/N=10）。

2.4 回收率

漁業(yè)養(yǎng)殖推廣技術(shù)建議魚飼料中17α-甲基睪丸酮的添加量為60 mg/kg，既可以有效地控制魚體的性別又能夠使成魚上市后在魚體內(nèi)的藥物消解完全，所以取標(biāo)準(zhǔn)添加量的25%、100%、200%作為加標(biāo)水平，即15、60、120 mg/kg。相對回收率通過內(nèi)標(biāo)來換算，范圍在94%～100%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最小值為1.97%，最大值為3.21%，具體結(jié)果見表1。

表1 魚飼料中17α-甲基睪丸酮的回收率（%，n=5）

2.5 準(zhǔn)確性與精密度

15、60、120 mg/kg 3個濃度的加標(biāo)水平在魚飼料樣品中17α-甲基睪丸酮檢測的批內(nèi)及批間結(jié)果考察方法的準(zhǔn)確性及精密度，結(jié)果見表2。批內(nèi)的回收率不低于97%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.64%～2.31%之間，批間的回收率不低于98%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2%。

表2 準(zhǔn)確性與精密度測定結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性

對檢測方法的細(xì)節(jié)稍作上下浮動10%的改變來考察本方法的穩(wěn)定性，具體變量條件為：①(12.0±1.0)ml甲醇提取魚飼料中MT和內(nèi)標(biāo)；②向甲醇中加入(即增加或減少10%)的蒸餾水以去除油和脂肪；③洗滌固相萃取管中甲醇濃度變化±10%；④改變水-甲醇中加入乙酸的濃度±25%；⑤改變最后從萃取管中洗脫MT和內(nèi)標(biāo)所用的甲醇體積±10%；⑥分別使用兩種固相萃取柱填充物；⑦使用兩種填充物的反相C18柱；⑧使用不同尺寸的C18柱；⑨25℃和40℃柱溫下進(jìn)行試驗。各做3次平行試驗，以MT和內(nèi)標(biāo)的峰面積及比值表示結(jié)果，并用F檢驗（ANOVA）分析判定。結(jié)果表明，前4個條件的改變對試驗結(jié)果影響不大，固相萃取柱的更換和溫度變化亦不會使目標(biāo)物質(zhì)的峰面積和線性產(chǎn)生重大變化，MT的F檢驗值范圍0.3～4.5，內(nèi)標(biāo)的F檢驗值范圍0.1～2.7。唯一對本方法有影響的變量條件是洗脫固相萃取柱所用的甲醇含量，10%的變化區(qū)間對內(nèi)標(biāo)的洗脫有明顯影響，而對MT的洗脫效果改變不大，甲醇含量45%時不能使內(nèi)標(biāo)物質(zhì)全部洗脫出來，導(dǎo)致MT與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值較大；而在甲醇≥50%含量時，達(dá)到最大值，所以導(dǎo)致MT與內(nèi)標(biāo)的峰面積比有較大變化（見圖5）。

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

漁業(yè)養(yǎng)殖推廣技術(shù)推薦雄化期用魚飼料中平均添加60 mg/kg的甲基睪丸酮含量，能夠有效地控制魚體雄性化，并能在成魚后基本消解完全。有文獻(xiàn)報道，在飼料中添加200 mg/kg質(zhì)量濃度的甲基睪丸酮，能夠起效的同時，使羅非魚在上市前體內(nèi)基本消解完全。本試驗是對在使魚體雄變的功能性飼料中添加甲基睪丸酮含量的檢測，其較養(yǎng)殖期、上市期產(chǎn)品及非功能性飼料中的含量高出幾十倍，故前處理及檢測方法與國標(biāo)GB/T 22260—2008不相同，本試驗參考美國藥典關(guān)于功能性飼料中MT的檢測方法，靈敏度范圍相對較大，相應(yīng)地，檢測值范圍也更寬闊。

3.2 甲基睪丸酮的降解

在高溫條件下，甲基睪丸酮在不同pH值環(huán)境下會降解成不同產(chǎn)物。通過UV和LC-MS（液質(zhì)聯(lián)用）的方法研究MT樣品發(fā)現(xiàn)，在甲醇-水溶液的中性環(huán)境下，升溫到70℃加熱1 h，超過98%的MT基本沒變化；在酸性條件下，得到其脫水產(chǎn)物[見圖6(2)]；在堿性條件下，主要的降解物為極性氧化產(chǎn)物，可能為烯丙基的氧化酮類混合物[見圖6(3)]，本試驗也對含有降解產(chǎn)物的樣品進(jìn)行檢測，得出降解產(chǎn)物對MT和內(nèi)標(biāo)的保留時間都不會產(chǎn)生影響，所以本方法是安全可行的，在樣品成分、雜質(zhì)、降解產(chǎn)物等共同存在的混合物中能夠高度準(zhǔn)確地測定出結(jié)果。

3.3 其他動物飼料

在觀賞魚飼料中添加甲基睪丸酮，可以使觀賞魚增色，色彩變得鮮艷亮麗；添加在貓飼料中使寵物貓皮毛鮮亮，身形矯健等，都屬于能夠增強動物觀賞性的功能性飼料，如果這些飼料與上述試驗方法中與各物質(zhì)出峰不沖突，并且含量大致在檢測范圍之內(nèi)，理論上都可以作為檢測MT的方法，這些還有待進(jìn)一步研究探索。

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