夏愛萍，龔鴻萍，鄭睿行

（衢州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測中心，浙江衢州，324002）

食品從生產(chǎn)、加工、儲存、運輸、銷售，到食用的整個過程，每個環(huán)節(jié)都容易受到各種途徑的污染，產(chǎn)生對人體有害因素。因此食品的安全問題，向來被每一個消費者所關(guān)注。食品的污染，主要分兩類：一類是化學物質(zhì)對食品的污染, 主要表現(xiàn)為化學殘留物、重金屬污染物。另一類是病原微生物所引起的食品污染，也稱生物性污染。這一類狀況最易發(fā)生。微生物導致危害的可能性遠遠超過其他來源的危害，它可引起因食品中細菌大量繁殖而導致食用者感染型中毒或因細菌繁殖產(chǎn)生菌毒素引起的毒素型中毒。細菌感染型中毒潛伏期較長，通常為10 多個小時，伴有發(fā)燒；而毒素型中毒則僅為2～4小時，很少發(fā)燒。

1 對人體健康危害較嚴重的致病菌

1.1 沙門氏菌

沙門氏菌為革蘭氏陰性的不產(chǎn)孢子的桿菌，主要分布在動物的腸道中，作為腸道菌群，它們會隨著糞便排泄出來，再由昆蟲和其它動物傳播到其它地方。沙門氏菌中毒往往源自病死牲畜肉、變質(zhì)動物性食品和蛋類，其所致的中毒是最常見食物中毒之一。中毒者會在進食后短期內(nèi)出現(xiàn)急性胃腸癥狀，如惡心，頻繁性嘔吐，腹痛、腹瀉；重者可發(fā)生高熱、脫水、昏迷、抽搐，很快死亡。

1.2 大腸桿菌

大腸桿菌在正常人的腸道內(nèi)存在，一般情況下不致病，但食用被該菌污染的食物時就會致病。大腸桿菌進入胃腸后會繼續(xù)繁殖，產(chǎn)生較重嘔吐、惡心、腹痛、腹瀉等胃腸癥狀,引起胃腸粘膜充血、水腫等病變。大腸桿菌引起的感染為最嚴重的食源性疾病之一。

1.3 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌存在于海水中，因此各種海產(chǎn)食物的帶菌率很高。當食用未煮熟海魚、海蜇，以及食用鹽腌制的并已被污染的肉類、蛋類、魚類、咸菜時，可引起中毒。中毒者胃腸癥狀嚴重，惡心嘔吐，腹痛，特別是腸糜爛、充血、水腫，并出現(xiàn)膿血水樣便，甚至發(fā)生休克、溶血現(xiàn)象。

1.4 李斯特菌

李斯特菌是革蘭氏陽性、不產(chǎn)孢子和不耐酸的桿菌，它們在自然界的分布廣泛，可以在腐爛的植物、土壤、動物糞便、污水、青貯飼料和水中被發(fā)現(xiàn)，部分正常人體內(nèi)也可帶有此菌。中毒原因主要是奶及乳制品、肉制品、水產(chǎn)品和水果蔬菜等未經(jīng)煮熟、煮透，冰箱內(nèi)冷藏的熟食品、乳制品取出后直接食用所導致。中毒者在8～24 小時內(nèi)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀。嚴重的可表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎等，也可引起心內(nèi)膜炎。

1.5 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌普遍存在于自然界中,正常人糞便中也可分離出此菌。金黃色葡萄球菌繁殖產(chǎn)生腸毒素常見于陳置米飯、淀粉類食品與奶制品，中毒者表現(xiàn)出反復嘔吐、劇烈腹痛等癥狀。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。

1.6 肉毒梭狀芽孢桿菌

肉毒桿菌食物中毒多由食用含有肉毒桿菌外毒素污染的食物而發(fā)生。此菌普遍存在于土壤家畜糞便中，可附著在水果、蔬菜、罐頭、火腿、膜腸肉里而大量繁殖外毒素，成人致死量為0.01mg。肉毒毒素主要侵犯神經(jīng)系統(tǒng)，中毒者會產(chǎn)生復視、肌肉麻痹、呼吸困難等癥狀，并伴有腦水腫和腦充血。

1.7 變形桿菌

變形桿菌在食品中能產(chǎn)生腸毒素，并且可以使蛋白質(zhì)中的組氨酸脫羧而形成組胺,從而引起胃腸炎或過敏性反應。中毒所引起的疾病可呈惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、頭暈、頭痛及發(fā)熱等癥狀或皮膚潮紅、頭痛、酒醉貌、蕁麻疹等過敏反應的表現(xiàn)[1]。

2 食品微生物快速檢測技術(shù)

2.1 氣相色譜法

其原理是將微生物細胞經(jīng)過水解、甲醇分解、提取以及硅烷化、甲基化等衍生化處理后，使之分離盡可能多的化學組分供氣相色譜儀進行分析。不同的微生物所得到的色譜圖中，通常大多數(shù)的峰是共性的，只有少數(shù)的峰具有特征性，可被用來進行微生物鑒定，分析檢測各種常見細菌、酵母菌、霉菌等。

2.2 “既用膠”測定法[2]

把1ml食物樣品傾入一盛有無菌液體培養(yǎng)基的試管中，混勻后再將混合物倒入一個裝有膠質(zhì)的特殊培養(yǎng)皿中。混合物與膠質(zhì)接觸后便形成瓊脂相似的復合物。經(jīng)培養(yǎng)后便可計數(shù)菌種及數(shù)量。該系統(tǒng)是包裝好的產(chǎn)品，用時不需滅菌，極適合野外測定。目前，這種系統(tǒng)正在受到美國AOAC（官方農(nóng)業(yè)化學家協(xié)會）的鑒定。

2.3 以生物化學手段建立的快速檢測技術(shù)

2.3.1 微生物專有酶快速反應系統(tǒng)的檢測技術(shù)

微生物專有酶快速反應是根據(jù)細菌在其生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應的底物和指示劑，將他們配制在相關(guān)的培養(yǎng)基中。根據(jù)細菌反應后出現(xiàn)的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應的測定結(jié)果有助于細菌的快速診斷。這種技術(shù)將傳統(tǒng)的細菌分離與生化反應有機地結(jié)合起來，并使得檢測結(jié)果直觀，正成為今后微生物檢測發(fā)展的一個主要發(fā)展方向。

2.3.2 常規(guī)的致病微生物檢測技術(shù)

不同病原體的化學組成或所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各異，利用微生物（主要是細菌）的不同生化和生理特性，可以對細菌進行鑒定。生化鑒定是檢測細菌最常用的方法。

2.4 以免疫學方法建立的快速檢測技術(shù)

免疫檢測的基本原理是抗原抗體反應。抗原抗體反應是指抗原與相應抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應。不同的微生物有其特異的抗原，并能激發(fā)機體產(chǎn)生相應的特異性抗體。在免疫檢測中，可利用單克隆抗體檢測微生物的特異抗原，也可利用微生物抗原檢測體內(nèi)產(chǎn)生的特異抗體，兩種方法均能判斷機體的感染狀況。

2.4.1 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence Technique）是用熒光素標記的抗體檢測抗原或抗體的免疫學標記技術(shù)，又稱熒光抗體技術(shù)。所用的熒光素標記抗體通稱為熒光抗體，免疫熒光技術(shù)在實際應用上主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加己知特異性熒光標記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法是在檢樣上滴加己知的細菌特異性抗體，待作用后經(jīng)洗滌，再加入熒光標記的第二抗體。

2.4.2 酶免疫測定技術(shù)

酶免疫測定（Enzyme immunoassay, EIA）根據(jù)抗原抗體反應是否需要分離結(jié)合的和游離的酶標記物而分為均相和非均相兩種類型。非均相法較常用，包括液相免疫測定法與固相免疫測定法。固相免疫測定法的代表技術(shù)是ELISA。ELISA 技術(shù)是抗原或抗體吸附到固相載體上作為一種試劑來檢測標本中抗體或抗原的一種方法。根據(jù)反應原理，加入某種酶標記的抗體或抗原，洗滌除去未結(jié)合物，加入該酶的底物，酶催化底物生成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物的量有關(guān)，根據(jù)反應顏色的深淺可定量測定。

2.4.3 免疫印跡技術(shù)

免疫印跡（Immunoblot）法分三個步驟：第一，SDS 聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。將蛋白質(zhì)抗原按分子大小和所帶電荷的不同分成不同的區(qū)帶。第二，電轉(zhuǎn)移。目的是將凝膠中己分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。第三，酶免疫定位，該步的意義是將前兩步中己分離，但肉眼不能見到的抗原帶顯示出來。將印有蛋白抗原條帶的硝酸纖維素膜依次與特異性抗體和酶標記的第二抗體反應后，再與能形成不溶性顯色物的酶反應底物作用，最終使區(qū)帶染色。本法綜合了SDS-PAGE的高分辨率及ELISA 的高敏感性和高特異性，是一種有效的分析手段。

2.4.4 免疫組織化學方法

免疫組織化學方法是應用免疫學中的抗原抗體反應，借助可見的標記物，在組織原位顯示抗原或抗體的方法。常用的免疫組織化學方法有熒光免疫和酶免疫組化技術(shù)、金標免疫組織化學技術(shù)和免疫電鏡，該技術(shù)特點是對細胞涂片、印片、組織切片進行處理和染色鏡檢。免疫組化技術(shù)彌補了上述血清學診斷方法的不足，使得在細胞或組織內(nèi)檢測病原微生物成分成為可能。對于在宿主組織液中微量表達或不表達抗原、抗體的微生物，免疫組化具有較好的輔助診斷價值。利用免疫組化技術(shù)，還能觀察被侵犯組織致病微生物繁殖和對組織破壞情況。

2.5 活細胞計數(shù)檢測

自動旋轉(zhuǎn)平板和激光菌落掃描計數(shù)法，在均勻薄層瓊脂營養(yǎng)基表面，以阿基米德螺旋線方式將液體樣品從中心到邊緣均勻涂在平板上。經(jīng)過培養(yǎng)在計數(shù)格區(qū)間內(nèi)計數(shù)，或用激光計數(shù)器來掃描平板，以透過光的強度來檢測菌落的存在。

PetrifiumTM系統(tǒng)用可重新水化的營養(yǎng)成分取代瓊脂傾注平板。把這種營養(yǎng)成分和一種膠態(tài)試劑一起嵌入在一系列薄膜上。取1mL液體樣品滴于膜系統(tǒng)中央，重新水化的培養(yǎng)基便可作為微生物生長的支持物，經(jīng)過培養(yǎng)后，便可像常規(guī)平皿計數(shù)一樣直接在膜系統(tǒng)上對菌落進行計數(shù)。Petrifium2000系列從菌群鑒定到結(jié)束只需培養(yǎng)8h。

Redigel系統(tǒng)（RCR Scientific）由多種營養(yǎng)成分與果膠混合并裝入試管，混勻后無需溶解凝膠。試樣直接加入試管后倒入覆蓋有一層鈣質(zhì)的培養(yǎng)皿中，倒入液體與鈣質(zhì)形成果膠鈣。培養(yǎng)后進行菌落計數(shù)。

疏水網(wǎng)膜（HGMF）技術(shù)是常規(guī)平皿劃線方法的改進。樣品用疏水網(wǎng)膜過濾，要檢測的微生物被捕獲在疏水網(wǎng)膜的小格中。在接種后的疏水網(wǎng)膜上傾入適當?shù)沫傊?，在適當時間培養(yǎng)后即可計數(shù)。由于菌落都是正方形，人工或機械計數(shù)都很方便?？捎糜诮湍负兔咕嫈?shù)、沙門氏菌檢測、大腸桿菌/大腸菌群檢測。

2.6 PCR檢測技術(shù)在食品病原微生物檢測中的應用

PCR技術(shù)由于其高度敏感性、特異性等特點使其在食品微生物檢測中得到了廣泛應用，而且由此衍生出了多種方法進行檢測。現(xiàn)在經(jīng)常應用的有實時熒光定量PCR、免疫PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR等，它們都是針對于食品中病原菌的特異性靶基因，通常是致病基因進行檢測。PCR技術(shù)和其它檢測技術(shù)(如核酸雜交等)聯(lián)合應用，展現(xiàn)了良好的前景。最新發(fā)展的熒光定量PCR技術(shù)更能檢測樣品中病原菌的數(shù)量，如對李氏桿菌[3]、沙門氏菌[4]、肉毒桿菌[5]、大腸桿菌O157∶H 7[6]等的檢測也都取得了良好效果。

2.7 生物芯片技術(shù)在食品病原微生物檢測中的應用[7]

生物芯片技術(shù)是近年來興起的一項綜合性的高新技術(shù)，它以微機電系統(tǒng)技術(shù)和生物技術(shù)為依托，將生命科學研究中的許多不連續(xù)過程（如樣品制備、生化反應、檢測等步驟）集成并移植到一塊普通郵票大小的芯片上去，并使這些分散的過程連續(xù)化、微型化，以實現(xiàn)對大量生物信息進行快速、并行處理的要求。基因芯片具有高通量能并行檢測的優(yōu)點,僅靠一個實驗就能檢測出大量的未知菌，所以基因芯片技術(shù)在微生物研究領(lǐng)域的成功經(jīng)驗為其應用于食品微生物特別是致病菌的檢測打下了基礎(chǔ)[7，8]。

2.8 傳感器技術(shù)在食品病原微生物檢測中的應用

生物傳感器主要是將生物、化學、熱變化、光效應、質(zhì)量信號等轉(zhuǎn)化為電信號的技術(shù)。目前已經(jīng)商品化的傳感器有酶傳感器、免疫傳感器、微生物傳感器、DNA雜交傳感器、細胞器傳感器、仿生傳感器、分子印跡傳感器等。光纖DNA生物傳感器是DNA生物傳感器中發(fā)展最晚，技術(shù)最新的一類，它的作用機理是利用石英的表面特性先接上一個連接物，然后將ssDNA或cDNA連接在光纖端面上，與目的基因進行雜交，雜交后的雙鏈DNA經(jīng)雜交嵌合劑產(chǎn)生的光效應而被檢測。目前光纖傳感器已經(jīng)應用到了測定污染食品中的大腸桿菌O157∶H 7、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌中。

2.9 流式細胞術(shù)FCM 在食品病原微生物檢測中的應用

該技術(shù)是用流式細胞儀對細胞懸液進行自動快速定量分析和分選的新技術(shù)，具有速度快、精確度高、記數(shù)細胞量大以及參數(shù)分析等全面測量細胞和分選細胞等優(yōu)點。由于FCM 檢測到的熒光強度的強弱與DNA片段的大小成比例，根據(jù)熒光濃度的直方圖就可知道細菌的DNA指紋圖譜，從而確定細菌的種類?，F(xiàn)在該技術(shù)已經(jīng)能夠檢測純化的DNA可達pg級水平，在10min內(nèi)可以完成數(shù)據(jù)的收集和分析。近年來在臨床實驗室已經(jīng)逐步用于病毒、細菌的檢測、計數(shù)、鑒定等。FCM 目前已經(jīng)發(fā)展到可測定DNA片段的大小，被認為是一種鑒定細菌很有發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。另外FCM 結(jié)合免疫熒光抗體檢測技術(shù)更能促進病原菌的特異性快速檢測。

2.10 基因探針技術(shù)在食品病原微生物檢測中的應用

該技術(shù)是從細菌中提取各自穩(wěn)定、特異的DNA片段，經(jīng)克隆提純，再將此DNA片段標記上可檢測的指示劑，如放射性同位素、熒光物質(zhì)等使之成為特異性的DNA探針。細菌經(jīng)過處理后固定于另一固相表面上，經(jīng)洗滌加入DNA探針進行雜交，DNA探針可以與同源性的靶DNA進行互補性結(jié)合，依據(jù)指示劑不同,選用合適的方法進行檢測。而且選用這個技術(shù)可以進行菌種和毒種鑒別。

最近又設(shè)計了一種DNA 指紋圖譜自動分析系統(tǒng)——Ribo PrinterTM(Dupont de Nemours公司產(chǎn)品）。具體操作是從細菌細胞中提取DNA,接著用限制性酶將DNA降解成片段，DNA片段通過電泳得到分開， 再轉(zhuǎn)移至雜交膜上與DNA探針雜交。由于引入了化學發(fā)光標記物，雜交片段發(fā)出的光線被相機捕獲，得到的核酸圖譜與其他貯存的DNA核酸堿基序列進行比較，通過核酸匹配分析可以對微生物進行鑒定。

微生物在食品中存在著很大的不安全性，會產(chǎn)生很多不安全因素，因此對食品中病原菌的快速檢測有著十分重要的意義。

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