邢國芳，宋萌，姚涵，韓淵懷

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，山西 太谷030801；3.山西運城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 運城044000）

在高等植物的生物周期中，開花是一個重要環(huán)節(jié)，植物從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的必然結(jié)果就是開花，而某些植物必須經(jīng)過一定的光周期才能形成花芽。光周期是指晝夜周期中光照期和暗期長短的交替變化，是生物對晝夜光暗循環(huán)格局的反應(yīng)，對晝夜以及四季的變化的判斷，是一種植物內(nèi)源的調(diào)節(jié)機制。晝夜節(jié)律鐘是植物體內(nèi)的晝夜生理節(jié)奏變化，以近似一天（24h）為一個單位［1］，在擬南芥中CCA1基因編碼一個MYB類結(jié)合蛋白，是光周期振蕩器的核心組分，CCA1突變體晝夜節(jié)律鐘的振幅變短［2］。邢國芳等［3］在禾本科植物玉米中發(fā)現(xiàn)CCA1基因?qū)庵芷谧兓舾胁⒂锌赡軈⑴c植物對光周期的反應(yīng)調(diào)控。大麥是一種禾本科植物，且當(dāng)前對其的光周期敏感性研究相對較少。因此，本研究擬利用BLAST手段通過同源克隆的手段電子克隆得到大麥CCA1的序列信息，結(jié)合RTPCR手段，克隆大麥CCA1基因，并與玉米、水稻、擬南芥的同源基因進行遺傳進化分析，另外對其在兩個大麥品種（華大麥1號和華大麥2號）葉片中的24h晝夜節(jié)律（16h光照／8h黑暗）過程中不同時間點的表達規(guī)律進行了研究，初步探明該基因?qū)Υ篼湽庵芷诘捻憫?yīng)規(guī)律，旨在為闡明大麥光周期敏感現(xiàn)象的分子機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

大麥品種華大麥1號和華大麥2號，具體操作參考前期在玉米中的研究方法［3］：種子浸泡發(fā)芽后盆栽，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天后（25℃光照16h／22℃黑暗8h）取地上部葉片，從ZT0（光照0小時）開始至ZT24（一個光暗循環(huán)），期間每隔3h取樣，共計9個時間點的樣品，每個樣品取5株材料，于液氮中速凍后置于－80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

按照Trizol Reagent（Invitrogen公司）試劑盒的說明書進行。提取總RNA后用DNaseI酶純化RNA以消除DNA污染。采用NANODROP微量核酸定量分析儀測定RNA的濃度以及吸光度比值（A260／280），并采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測樣品質(zhì)量，最后加入適量的ddH2O使其溶解到終濃度1g·L－1。采用Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄酶（M－MLV）進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系以及程序按照其說明書進行：反應(yīng)總體積20μL，其中，包含總RNA 2μg，Random Primer 1μg，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液5μL，10mM dNTP混合物5μL，M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶200U，RNA酶抑制子0.5μL。

利用內(nèi)標基因Actin檢測cDNA質(zhì)量，Actin引物S1：5＇－CAC TGC AAT GGT CAA GGC TG－3＇，S2：5＇－CTC CAT GTC ATC CAG TTG AT－3＇。PCR循環(huán)數(shù)30個。

1.3 生物信息分析

利用文獻中報道的CCA1基因同源序列作為靶序列。利用電子克隆手段獲得大麥的CCA1基因序列，（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）結(jié)合RT－PCR手段克隆測序得到大麥CCA1基因序列，并與其同源序列進行遺傳進化分析，另外對其編碼蛋白的氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)域分析。利用MEGA4.1軟件構(gòu)建進化樹。蛋白結(jié)構(gòu)域分析通過在 線 進 行 （http：／／plantsp.genomics.purdue.edu／html／feature＿scan.html）。

1.4 大麥CCA1基因的克隆

根據(jù)電子克隆到的大麥CCA1基因序列，設(shè)計包含全長ORF序列的基因特異引物F1：5＇－CCT GGA ATT GGA GAT GGA GA－3＇，F(xiàn)2：5＇－AAG GAA CCG TTT GTG CTC TG－3＇，以ZT6的cDNA為模板PCR擴增30個循環(huán)，電泳并通過瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，采用T4連接酶與PGEM－T載體16℃連接過夜，熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5а，藍白斑篩選并結(jié)合PCR獲得陽性克隆，送往華大基因公司測序，得到大麥CCA1基因的全長cDNA序列。分析其編碼蛋白的氨基酸序列，在線（http：／／isoelectric.ovh.org／files／calculate.php）預(yù)測其分子量和等電點，采用DNAMAN軟件與其他物種的同源序列進行比對。

1.5 熒光實時定量PCR分析

1.5.1 引物設(shè)計和標準曲線的建立［4］

BLASTn分析，獲得大麥CCA1基因的3＇非翻譯區(qū)，并在此區(qū)間設(shè)計特異的表達檢測引物，Q1：5＇－ACT TAG ACG CAT CGA ATC AT－3＇，Q2：5＇－TAT GCA TCC TGC GAT AGC AC－3＇，覆蓋序列135bp。以其擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌的質(zhì)粒作為CCA1和Actin基因的標準品。按照10倍的濃度梯度進行稀釋，設(shè)計5個濃度梯度，分別作為熒光定量PCR的模板，對CCA1基因和Actin的相對表達豐度進行定量檢測，每個濃度梯度進行2次重復(fù)實驗。根據(jù)擴增的CT值及濃度梯度建立標準的定量曲線。

1.5.2 熒光定量PCR及數(shù)據(jù)分析

實時熒光定量PCR選用Bio－Rad C1000cycler Real Time PCR system進行分析，反應(yīng)體系10μL，包含1μL的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，0.2μM的引物和5μL的SYBR Premix Ex Taq（DRR041D）每個反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)，PCR程序如下：94℃變性5 min；35個循環(huán)的反應(yīng)為94℃變性10s，60℃ 退火20s，72℃延伸30s；最后72℃延伸7min；65～98℃繪制溶解曲線。然后采用比較閾值法對實時定量結(jié)果進行定量分析，手工設(shè)置熒光域值，確定在該熒光域值下特定的循環(huán)數(shù)Ct值，根據(jù)Ct值，計算各樣品的C值，C＝2－ΔCT，ΔCt＝Ct目標基因－Ct內(nèi)標基因。采用雙尾等方差t測驗的方法進行顯著性檢驗（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA樣品制備

電泳檢測發(fā)現(xiàn)所有樣品RNA的28S與18S條帶清晰，吸光度比值 A260／280均在1.8～2.1之間，表明RNA質(zhì)量完好，純度很高。采用S1和S2引物在所有樣品中擴增均得到135bp的產(chǎn)物，說明cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄成功。

2.2 CCA1基因的克隆和分析

以ZT6的cDNA材料為模板，利用引物F1和F2進行擴增、克隆并回收測序，采用ORF Finder軟件分析，發(fā)現(xiàn)其序列中2157bp的開放閱讀框編碼蛋白質(zhì)含有718個氨基酸殘基（圖1），在線預(yù)測到其編碼蛋白分子量為77 769.4Da，等電點為6.55。經(jīng)BLAST分析，發(fā)現(xiàn)該基因片段與水稻序列（AY452478）相似性可達72%，與玉米CCA1序列（EU955544.1）相似性達69%（圖2）。

圖1 BaCCA1編碼蛋白分析Fig.1 The amino acids sequences of BaCCA1

圖2 不同物種CCA1基因氨基酸序列分析Fig.2 Multiple alignment of the CCA1conserved domain of Hordeum vulgare（barley）with those of Oryza sativa（rice），Zea mays（maize）and Arabidopsis thalianain amino acids sequences

分析發(fā)現(xiàn)，該基因的SANT蛋白結(jié)合域相似性很高，其與單子葉植物水稻（AAR20887）和玉米（BAJ92173.1）以 及 雙 子 葉 植 物 擬 南 芥 （NP＿850460.1）的序列高度保守，相似度分別達到94.33%、95.26%和78.44%（圖2）。因此根據(jù)氨基酸序列上的相似性，利用 MEGA4.0軟件繪制了CCA1蛋白的遺傳進化樹。發(fā)現(xiàn)單子葉植物玉米、水稻和大麥聚在同一個類群（圖3），說明在該基因在進化上應(yīng)始于單雙子葉植物分化之后。

圖3 大麥、水稻、玉米以及擬南芥CCA1蛋白進化分析Fig.3 The Phylogenetic tree of the CCA1protein

2.3 BaCCA1基因表達分析

為了檢測PCR引物擴增目的基因的特異性，我們對Actin基因的標準質(zhì)粒進行測序發(fā)現(xiàn)其與目的基因沒有出現(xiàn)SNP的差異。用引物S1與S2對標準品質(zhì)粒進行PCR擴增，均得到了大小相同的片段。對標準品進行定量得到BaCCA1基因的標準 曲 線 Y＝ －0.283X＋9.045，相 關(guān) 系 數(shù)0.9939。Actin基因的標準曲線為Y＝－0.284X＋8.988，相關(guān)系數(shù)為0.9982。兩條標準曲線的斜率相差非常小，相關(guān)系數(shù)均接近1，熒光定量的溶解曲線為單峰，表明擴增產(chǎn)物的特異性很好，目的產(chǎn)物的擴增可以用熒光曲線來準確地反眏。

對不同的時間點的表達數(shù)據(jù)采用方差分析發(fā)現(xiàn)，不同時間點及處理情況下的表達量差異均達到顯著水平。表1及圖4顯示，在16h光照／8h黑暗條件下，CCA1基因從開始光照時表達量達到最高峰，之后逐漸下降到最低水平，然后迅速上升到ZT24時恢復(fù)到與ZT0相同的水平，完成一個循環(huán)周期；在華大麥1號和2號品種間表達曲線是相似的，但華大麥2號的曲線要比華大麥1號的曲線緩，其下調(diào)及上調(diào)的比例均小于華大麥1號。

表1 BaCCA1在兩種大麥品種間的相對表達量Table 1 The relative expression of BaCCA1between two different varieties

3 討論

圖4 BaCCA1基因在華大麥1號和華大麥2號中的表達Fig.4 The relative expression of BaCCA1between two different varieties

植物體內(nèi)存在一種以24h為周期的內(nèi)源調(diào)節(jié)機制，能夠影響植物體內(nèi)的一系列生理進程包括基因的表達、代謝調(diào)控以及生殖過程等［5］。植物通過感知光周期的變化，來判斷晝夜以及四季的變化。最近在擬南芥中發(fā)現(xiàn)這一過程的實現(xiàn)是通過一些基因的在白天與黑夜間的震蕩性的表達來實現(xiàn)的［6，7］，其中主要是通過形成一個轉(zhuǎn)錄－翻譯水平的反饋抑制環(huán)［6］，包含一個清晨表達的MYB轉(zhuǎn)錄因子－CCA1以及其負調(diào)控的下游基因TOC1。

大麥CCA1基因，具有2157bp的完整讀碼框，編碼一條718個氨基酸殘基的肽鏈，含有一個保守的MYB蛋白結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域在擬南芥、水稻、玉米、大麥中都存在，并且相似性高達93.22%，說明該基因在單子葉植物和雙子葉植物之間及其保守。

CCA1基因在光照剛開始時mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物開始積累，到光照3小時達到峰值，之后又慢慢開始下調(diào)表達這與擬南芥、和玉米中的研究結(jié)果相似［3，8］。說明我們克隆的大麥CCA1基因與擬南芥中的CCA1基因在光周期途徑中發(fā)揮的功能是相似的。

植物的生命活動是一個復(fù)雜而有序的過程，植物本身能夠識別外界季節(jié)和晝夜節(jié)律的變化，進而做出相應(yīng)的利于植物開花和發(fā)育等的反應(yīng)，如從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變?yōu)檫m于開花的節(jié)奏程序，秋季日照逐漸縮短時，從旺盛的生長轉(zhuǎn)向休眠等。晝夜節(jié)律的改變將會影響光周期相關(guān)基因的表達，從而有效的維持植物體的生命活動。植物體對溫度具有敏感性，通過實驗證明，內(nèi)源節(jié)奏的周期長度對溫度相對不敏感，暗示它不是以化學(xué)變化為基礎(chǔ)的，但內(nèi)源節(jié)奏的振幅可能與溫度的變化有關(guān)。這主要是因為植物多種生化反應(yīng)受到溫度影響，這對植物的正常生長是有利的。當(dāng)植物體處于最適溫度時，正常生長，代謝旺盛，而當(dāng)溫度變化異常時，進行內(nèi)部調(diào)節(jié)，避免傷害。當(dāng)然，植物體內(nèi)的生物鐘系統(tǒng)對環(huán)境溫度波動過于敏感的話，也會對植物體產(chǎn)生不利的影響，植物體會因?qū)囟冗^度敏感受到嚴重的干擾而造成生命活動的紊亂［9］。

到目前為止，雖然大麥光周期敏感性的遺傳特點及分子機制研究方面已經(jīng)取得了一些進展，但與擬南芥和水稻相比仍然相距甚遠，尤其在光周期敏感性的分子機理方面的研究知之甚少，主要是因為目前克隆到的與大麥開花有關(guān)的基因相對較少，目前對大麥光受體的功能報道也很少，生物節(jié)律鐘基因的功能鑒定幾乎是空白。但是，高等植物開花的光周期途徑關(guān)鍵基因的保守性和單子葉作物的共線性關(guān)系能夠幫助我們?yōu)榇篼湽庵芷诿舾谢虻目寺√峁┮欢ǖ囊罁?jù)［10，11］，特別是高通量測序技術(shù)的發(fā)展，以及相關(guān)物種基因組序列的公布，為解析大麥光周期遺傳機理提供了便利。解析大麥光周期敏感機制將對大麥的生產(chǎn)起到一定的指導(dǎo)意義。

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