陜西省鎮(zhèn)安縣醫(yī)院（鎮(zhèn)安711500） 柯 俊 胡應(yīng)秀 王 康

Notch信號(hào)通路是重要的發(fā)育分化通路之一［1］，參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡過程。最新研究顯示Notch信號(hào)通路也參與肺癌、胰腺癌、基底細(xì)胞癌等腫瘤演進(jìn)過程［2］。胃癌細(xì)胞和組織中都高表達(dá)Notch1蛋白［3］，提示Notch1蛋白可能在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。本研究使用Notch1蛋白特異性抑制劑木黃酮干預(yù)胃癌細(xì)胞MKN－45，探討Notch1在胃癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用。

材料與方法

1 材 料 人胃癌細(xì)胞株MKN－45細(xì)胞購自中科院上海生命研究所。DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司。四甲基偶氮唑鹽（MTT），二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司。兔抗人Notch 1多克隆抗體，鼠抗人β－actin單克隆抗體，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗均購自Santa Cruz公司。Annexin V－FITC/PI熒光雙標(biāo)試劑盒購自深圳生物元公司。PCR Mix購自西安潤德公司，PCR引物合成于上海生工公司。木黃酮（Genistein）購自Calbiochem公司，并以DMSO溶解配制成100mmol/L濃度保存于－20℃?zhèn)溆?。?duì)照組細(xì)胞使用相應(yīng)濃度DMSO處理。

2 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) 人原發(fā)性胃癌細(xì)胞株MKN－45于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)，2～3d用0.25%胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。分組：等濃度DMSO溶劑對(duì)照（正常對(duì)照）組、10μmol/L木黃酮（10μM 木黃酮）組、30μmol/L 木 黃 酮 （30μM 木 黃 酮）組 和50μmol/L木黃酮（50μM 木黃酮）組。

3 MTT法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的MKN－45細(xì)胞，制成懸液，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液為200μl。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12h后換加無血清DMEM培養(yǎng)液200μl繼續(xù)培養(yǎng)12h，使細(xì)胞周期同步化，然后換加含10%血清培養(yǎng)液，分別再培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、60h、72h后終止培養(yǎng)，在避光條件下加5mg/ml MTT溶液20μl/孔，孵育4h，棄上清液，避光條件下加DMSO 150μl/孔，置酶標(biāo)儀上振蕩10min。以空白孔調(diào)零，測(cè)各孔490nm吸光度（OD）值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分組干預(yù)細(xì)胞，到達(dá)預(yù)訂時(shí)間點(diǎn)后，PBS沖洗1次，常規(guī)消化，1500rpm離心5min，棄去上清，用PBS再洗滌1次，1500rpm離心5min后棄去上清，加入500μl的1×Binding Buffer后加入5μl Annexin V－FITC，再加入10μl PI，輕輕混勻。室溫下，避光反應(yīng)5～15min。1h后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC－/PI－）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC＋/PI＋）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC＋/PI－）。

5 Westen blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 選擇生長良好的細(xì)胞1×107個(gè)，蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS－PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1h。加一抗稀釋液4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后加入二抗稀釋液室溫孵育1h。ECL化學(xué)發(fā)光，暗室顯影。

6 PCR檢測(cè)mRNA轉(zhuǎn)錄 用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA。取5μg按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增Bcl－2，Bax，以GAPDH為內(nèi)參照。各目的基因引物序列如下：Bcl－2：5’－GGA TTG TGG CCT TCT TTG AG－3’，5’－CCA AAC TGA GCA GAG TCT TC－3’（擴(kuò)增片段 234 bp）；Bax：5’－TCC ACC AAG AAG CTG AGC GAG－3’，5’－GTC CAG CCC ATG ATG GTT CT－3’（擴(kuò)增片段 257bp）；GAPDH：5’－GTA AAG ACC TCT ATG CCA TCA－3’，5’－GGA CTC ATC GTA CTC CTG CT3－3’（擴(kuò)增片段452bp）。PCR反應(yīng)條件：94℃30s，60℃30s，72℃30s共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照。用Quantity One軟件對(duì)照片進(jìn)行灰度值掃描，以目的條帶與其相應(yīng)內(nèi)參GAPDH的光密度比代表目的基因mRNA的相對(duì)水平。每一時(shí)間點(diǎn)上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS15.0軟件處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用單因素方差分析，其中多組資料兩兩比較采用LSD多重檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 木黃酮干預(yù)對(duì)MKN－45細(xì)胞增殖的抑制作用見圖1。MTT結(jié)果顯示，木黃酮干預(yù)明顯抑制MKN－45細(xì)胞的增殖。在12、24、36、48、60、72h，正常對(duì)照組的OD值分別為0.366±0.026、0.482±0.011、0.648±0.029、0.859±0.043、1.117±0.017、1.483±0.057，10μM 木黃酮組的 OD 值分別為0.364±0.013、0.458±0.052、0.634±0.046、0.798±0.028、0.978±0.034、1.359±0.058，30μM 木黃酮組的 OD值分別為0.364±0.022、0.381±0.005、0.460±0.037、0.576±0.029、0.81±0.087、0.827±0.036，50μM 木黃酮組的OD值分別為0.330±0.016、0.318±0.014、0.434±0.031、0.479±0.027、0.71±0.087、0.727±0.092。自36h開始，30μM木黃酮組和50μM木黃酮MKN－45細(xì)胞增殖率與正常對(duì)照組（P＜0.05）或10μM木黃酮組（P＜0.05）相比，差異均有顯著性意義。

圖1 木黃酮干預(yù)對(duì)MKN－45細(xì)胞增殖的抑制作用

2 木黃酮干預(yù)對(duì)MKN－45細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)的抑制作用 見圖2。木黃酮干預(yù)MKN－45細(xì)胞48h，經(jīng) Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖2A）：與正常對(duì)照組（1.06±0.06）相比，30μM 木黃酮組（0.50±0.02）和50μM 木黃酮組（0.24±0.04）細(xì)胞 Notch 1蛋白的表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）；而10μM木黃酮組（0.95±0.06）和正常對(duì)照組之間 Notch1蛋白的表達(dá)水平無明顯差異。

圖2 木黃酮干預(yù)對(duì)MKN－45細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)的抑制作用

3 木黃酮干預(yù)對(duì)MKN－45細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用見圖3。不同濃度木黃酮干預(yù)細(xì)胞48h，通過Annexin V－FITC/PI熒光雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡狀況。結(jié)果（圖3A）發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組、10μM木黃酮組、30μM木黃酮組和50μM木黃酮組凋亡細(xì)胞數(shù)分別為3.13±0.78，3.82±0.99，7.96±10.90和13.49±0.82，4組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對(duì)照組或10μM木黃酮相比，30μM木黃酮和50μM木黃酮組 MKN－45細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)明顯上調(diào)（P＜0.05）（圖3B）。

圖3 木黃酮干預(yù)對(duì)MKN－45細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用

4 木黃酮干預(yù)對(duì) MKN－45細(xì)胞Bcl－2和Bax mRNA表達(dá)的抑制作用 見圖4。木黃酮干預(yù)MKN－45細(xì)胞48h，通過RT－PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞的Bcl－2和Bax mRNA表達(dá)水平（圖4A）。結(jié)果顯示：30μM木黃酮和50μM木黃酮組 MKN－45的Bcl－2mRNA的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度與正常對(duì)照組（P＜0.05）或10μM木黃酮組（P＜0.05）相比明顯下調(diào)，差異具有顯著性意義；同時(shí)，Bax－2mRNA的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度與正常對(duì)照組（P＜0.05）或10μM 木黃酮組（P＜0.05）相比明顯上升，差異具有顯著性意義（圖4B）。

圖4 木黃酮干預(yù)對(duì)MKN－45細(xì)胞Bcl－2和Bax mRNA表達(dá)的抑制作用

討 論

Notch信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞分化、發(fā)育的關(guān)鍵性通路。Notch蛋白是一個(gè)進(jìn)化高度保守的跨膜受體蛋白家族。在人體細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)了Notch1、Notch2、Notch3和Notch4共4個(gè)Notch同源體。1991年Ellisen LW在人類T淋巴母細(xì)胞白血病中鑒定出Notch1，首次提示了Notch信號(hào)通路與腫瘤有關(guān)［4］。近年來日漸增多的證據(jù)表明Notch1與腫瘤發(fā)生密切關(guān)聯(lián)，各種腫瘤中起致癌作用［1］。胰腺癌細(xì)胞中Notch1的下調(diào)表達(dá)明顯抑制了癌細(xì)胞的生長和促進(jìn)凋亡［5］。Notch1在不同腫瘤乃至同一腫瘤中不同的、甚至相反的作用，提示闡明Notch信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制尚需大量的探索研究。木黃酮是來源于豆類植物的一種小分子黃酮類物質(zhì)。該物質(zhì)具有一系列廣泛多樣的生物活性，對(duì)腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì)疏松、糖尿病、皮膚病等疾病的發(fā)生有一定的預(yù)防和治療作用，其中最重要的作用是抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展［6］。雖然研究表明異黃酮抗腫瘤的分子機(jī)制可能抑制原發(fā)腫瘤增殖和凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)［7］，但是具體機(jī)制尚未完全明了。最新研究顯示了木黃酮具有特異性的Notch1蛋白抑制活性，其抑制效果與Notch1蛋白R(shí)NA干擾相當(dāng)［8］，顯示了具有相當(dāng)前景的腫瘤治療潛力。本研究發(fā)現(xiàn)通過不同濃度的木黃酮干預(yù)人源性胃癌MKN－45細(xì)胞，結(jié)果提示：與正常對(duì)照組相比，30μM 和50μM 異黃酮顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，其效果和干預(yù)時(shí)間有關(guān)。這與文獻(xiàn)報(bào)道木黃酮抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力的結(jié)果相符［9］。研究中，我們選擇了木黃酮對(duì) MKN－45細(xì)胞增殖發(fā)生明顯影響的干預(yù)48h這個(gè)時(shí)間點(diǎn)做進(jìn)一步試驗(yàn)。Western blot結(jié)果顯示木黃酮能下調(diào)Notch 1蛋白表達(dá)，其程度和趨勢(shì)與抑制細(xì)胞增殖基本相符，提示其抗增殖作用與抑制Notch 1蛋白表達(dá)相關(guān)。通過流式細(xì)胞術(shù)分析，我們發(fā)現(xiàn)木黃酮能顯著誘導(dǎo)胃癌MKN－45細(xì)胞凋亡，其效果與木黃酮濃度和Notch 1蛋白抑制程度存在正向關(guān)聯(lián)。因而我們推測(cè)木黃酮通過抑制Notch1后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制是與Notch1相關(guān)的凋亡信號(hào)通路活性受到上調(diào)。

因此本研究使用RT－PCR檢測(cè)不同濃度木黃酮干預(yù)胃癌MKN－45細(xì)胞48h后凋亡相關(guān)分子Bcl－2和Bax mRNA的表達(dá)。Bcl－2基因是一種原癌基因，它具有抑制凋亡的作用。在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl－2家族成員起著至關(guān)重要的作用［10］。Bcl－2家族可以分為兩大類，一類是抗凋亡的，主要有Bcl－2、Bcl－XL、Bcl－W 等，另一類是促細(xì)胞死亡的，主要包括Bax、Bak、Bad、Bik、Bid等。Bcl－2是細(xì)胞凋亡的負(fù)性因子，能保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。Bax是極重要的促細(xì)胞凋亡基因，有對(duì)抗Bcl－2抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bcl－2/Bax之間的比例，是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，Bcl－2＞Bax時(shí)細(xì)胞趨于存活；Bax＞Bcl－2時(shí)細(xì)胞趨于凋亡。我們發(fā)現(xiàn)，木黃酮干預(yù)胃癌細(xì)胞48h時(shí)，伴隨著Notch1表達(dá)受抑和凋亡細(xì)胞數(shù)上升，其Bcl－2mRNA下調(diào)，Bax mRNA上調(diào)。結(jié)果說明經(jīng)木黃酮干預(yù)胃癌細(xì)胞MKN－45抑制Notch l蛋白表達(dá)后，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)分子Bcl－2和Bax誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。

總之，我們應(yīng)用木黃酮特異性抑制胃癌細(xì)胞MKN－45的Notch l表達(dá)，通過抑制Notch通路活性而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，由此研究Notch通路在胃癌分子病理機(jī)制中的重要作用，并展示了木黃酮作為Notch 1特異性抑制劑在治療胃癌方面的廣泛前景，為胃癌治療新手段提供理論依據(jù)。

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