方芳,張恒,趙玉萍,李文兵,楊磊,李東陽

摘要：利用水煎法、醇提取法和超聲波提取法制備天門冬（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｌｏｕｒ） Ｍｅｒｒ．）提取液，并通過正交試驗對超聲波提取工藝進行優(yōu)化；采用杯碟法測定天門冬提取液的抑菌圈直徑；采用液體稀釋法測定最低抑菌濃度。結果表明，超聲波提取所用條件為７０％的乙醇、浸泡時間６ ｈ、提取時間２０ ｍｉｎ和提取溫度３５ ℃時，所得天門冬提取液對金黃色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）和黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）抑制作用最強，對這３種菌的最低抑菌濃度分別為３．１３、６．２５和１２．５０ ｍｇ／ｍＬ。說明天門冬提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉有較強的抑制作用，是一種天然抑菌劑。

關鍵詞：天門冬（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｌｏｕｒ） Ｍｅｒｒ．）；提取工藝；抑菌作用

中圖分類號：Ｑ９４６．８８７；Ｒ２８４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）05－0931-03

In vitro Antimicrobial Test of Asparagus cochinchinensis （Lour） Merr.

ＦＡＮＧ Ｆａｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｈｅｎｇ，ＺＨＡＯ Ｙｕ－ｐｉｎｇ，ＬＩ Ｗｅｎ－ｂｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｌｅｉ，ＬＩ Ｄｏｎｇ－ｙａｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｈｕａｉｙｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｉ＇ａｎ ２２３００３， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ （ｗａｔｅｒ ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ， ａｌｃｏｈｏｌ ｒｅｆｌｕｘ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ） ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｃｙｌｉｎｄｅｒ ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉａｍｅｔｅｒ． Ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ the ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ）． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃting ｆｏｒ ２０ ｍｉｎ ａｔ ３５ ℃ ｗｉｔｈ ７０％ ｅｔｈａｎｏｌ ａｆｔｅｒ ｉｍｍｅｒｓｉｎｇ ６ ｈ． Under ｔｈｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｈａｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ｔｈｅ ＭＩＣ ｗａｓ ３．１３ ｍｇ／ｍＬ）， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （ｔｈｅ ＭＩＣ ｗａｓ ６．２５ ｍｇ／ｍＬ） ａｎｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ｔｈｅ ＭＩＣ ｗａｓ １２．５０ ｍｇ／ｍＬ）． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ against Ｓ. ａｕｒｅｕｓ， Ｅ. ｃｏｌｉ ａｎｄ Ａ. ｎｉｇｅｒ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｉｔ ｉｓ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ） Ｍｅｒｒ； ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ

天門冬（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ）Ｍｅｒｒ）為百合科天門冬屬的一種，其干燥塊根可以入藥［１］，有養(yǎng)陰清熱、潤燥生津之功效［２］。目前，關于天門冬的研究主要集中于化學成分、藥理、栽培和野生資源開發(fā)等方面。對其抑菌能力的研究不多。已有的文獻顯示，天門冬提取液對炭疽桿菌２０６、甲型及乙型溶血性鏈球菌、白喉桿菌、大腸桿菌、痢疾志賀氏菌、類白喉桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、檸檬色葡萄球菌、白色葡萄球菌及枯草桿菌均有不同程度的抑制作用［３，４］?？梢?，天門冬具備一定的抑菌能力，有望將其提取液加入到香皂或洗手液等洗化用品中，制成抑菌洗化用品。目前市面上知名的抑菌洗化用品多是利用三氯卡班、對氯間二甲苯酚、ＤＭＤＭ乙內(nèi)酰脲等化學物質(zhì)抑菌，而如能利用天門冬這種藥食同源的植物制成提取液來抑菌，則更為健康安全。另據(jù)《月華于本草》記載，天門冬能“鎮(zhèn)心，潤五臟，益皮膚，悅顏色”；《本草綱目》記載，天門冬與蜂蜜一起混合搗成液狀攙入洗臉水，連續(xù)用一個月皮膚即變白嫩。因此將天門冬提取物加入到洗化用品中，洗化用品的品質(zhì)則可大幅度提升，可同時達到抑菌、護膚和美白的功效。本研究主要利用３種方法（水煎法、醇提取法和超聲波提取法）制備天門冬提取液，考察不同提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黑曲霉的抑菌效果，旨在為制備天門冬抑菌洗化用品提供參考。

１材料與方法

１．１材料

天門冬塊根購于淮安藥房，產(chǎn)地為貴州。

１．２儀器、試劑與菌種

ＦＷ８０型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；ＨＨ－４數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市晶玻實驗儀器廠）；ＤＳＸ－２８０Ｂ不銹鋼手提式滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；ＢＣＭ－１０００超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；ＤＨ３６００電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；超聲波清洗器、旋轉蒸發(fā)器、電爐、分析天平、１０．０ ｍｍ×７．８ ｍｍ×（６．０±０．１） ｍｍ牛津杯和其他實驗室常用玻璃儀器。

牛肉浸膏，蛋白胨，氯化鈉、瓊脂、乙醇、石油醚、葡萄糖等均為分析純。

供試菌株３種：金黃色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ），大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，黑曲霉采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。

１．３方法

１．３．１天門冬提取液制備方法

１）水煎法［５］。稱取天門冬塊根１００ ｇ，冷水浸泡２０～３０ ｍｉｎ，分２次加水煎煮：第一次加水６００ ｍＬ，第二次加水４００ ｍＬ，均待水燒開后改用文火煮３０ ｍｉｎ，用４層紗布過濾；合并２次濾液，除去藥渣，水浴加熱濃縮至１００ ｍＬ，即得到濃度為１ ｇ／ｍＬ的天門冬提取液。經(jīng)高壓蒸氣滅菌后備用。

２）醇提取法［６，７］。稱取天門冬塊根粉末２０ ｇ ２份，并用紗布包裹，各自放入索氏提取器內(nèi)，為了保持固液比為１∶１０，在圓形瓶中分別加入２００ ｍＬ ５０％乙醇和９０％乙醇，接好裝置后，兩組各自回流２ ｈ?；亓鹘Y束后，將回流液體用旋轉蒸發(fā)器濃縮至含生藥１ ｇ／ｍＬ，過濾滅菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

３）超聲波提取法［８］。采用４００ Ｗ的功率對天門冬塊根粉末進行超聲提取。提取過程中，對提取效果影響較大的因素主要有浸泡時間、提取溫度、提取時間、有機溶劑、固液比等，其中固液比以１∶１０～１５為宜。因此本試驗固定固液比為１∶１０，以浸泡時間、提取溫度、提取時間、有機溶劑為變化因素，超聲提取結束后，將提取液４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ， 各提取濾液用旋轉蒸發(fā)器濃縮至含生藥１ ｇ／ｍＬ，過濾滅菌，以天門冬提取液抑菌效果為評價指標，通過Ｌ９（３４）正交試驗（表１）考察天門冬抑菌物質(zhì)的最佳提取工藝。

１．３．２天門冬提取液抑菌活性測定采用杯碟法測定提取液抑菌活性。取濃度為２．０×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ的各種待測菌懸液０．１ ｍＬ，涂布在相應凝固培養(yǎng)基平板上，之后將每個平板放入２個滅菌牛津杯，其中１個為平行，１個為對照（水煎法以無菌水為對照；醇提取法以同一浸提含量的乙醇為對照；超聲波提取法以浸提用有機溶劑為對照）。分別用移液槍取不同提取方法所得的天門冬提取液加入牛津杯中，細菌３７ ℃、黑曲霉２８ ℃培養(yǎng)２４ ｈ后，移去牛津杯，測定抑菌圈直徑，每組平行３次，取其平均值。

為了更準確地反映天門冬塊根中所含物質(zhì)的抑菌效果，而非有機溶劑對菌株的抑制作用，故定義本文中抑菌圈直徑＝試驗組抑菌圈直徑－對照組抑菌圈直徑。

１．３．３天門冬提取液最小抑菌濃度（ＭＩＣ）測量在小試管中先加入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基１．６ ｍＬ，再加入０．２ ｍＬ ２．０×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ測試菌液，最后加入倍比稀釋的天門冬提取液（用上面試驗得到抑菌效果最佳的提取方法制備，將原液濃度視為１００％）０．２ ｍＬ，混勻，以無菌水作為空白對照。每個濃度做３ 個平行，細菌于３７ ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２４ ｈ。黑曲霉于２８ ℃培養(yǎng)４８ ｈ。肉眼觀察試管濁度，以不顯示濁度的最低藥液濃度作為ＭＩＣ［９，１０］。

２結果與分析

２．１水煎法所得天門冬提取液的抑菌效果

從抑菌試驗結果（表２）可以看出，水煎法所得天門冬提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黑曲霉都有較強的抑制作用，而且對細菌的抑制作用略強于對真菌的抑制作用。

２．２醇提取法所得提取液的抑菌效果

試驗結果（表３）表明，用９０％的乙醇所得的天門冬提取液對金黃色葡萄球菌、黑曲霉的抑菌效果比５０％的乙醇好，但對大腸桿菌的抑菌效果比５０％的乙醇略差。但醇提取法相對于水煎法來說，效果明顯要好。

２．３超聲波提取法所得提取液的抑菌效果

正交試驗結果（表４）表明，有機溶劑對于抑菌效果的影響最為顯著，其次是浸泡時間、提取時間。浸泡時間和提取時間需適中，過長可能會破壞天門冬提取液中有效抑菌物質(zhì)，過短又可能不利于有效抑菌物質(zhì)的浸出。提取溫度對試驗影響不很顯著，可能因為選取的３個溫度相差不大，沒有過高或過低的溫度。通過綜合評分，得出超聲波提取法的最優(yōu)方案為Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ１，即浸泡時間６ ｈ，提取時間２０ ｍｉｎ，提取溫度３５ ℃，有機溶劑選用７０％的乙醇。但是優(yōu)化方案并沒有出現(xiàn)在９組試驗中，為了證實理論分析，進行了補充驗證試驗。在此優(yōu)化方案下進行提取，提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黑曲霉抑菌圈直徑（減去對照后）分別為２５．７、２２．７、２１．７ ｍｍ，都大于其他試驗組，表明優(yōu)化方案成立。

２．４天門冬提取液最小抑菌濃度（ＭＩＣ）

用上述優(yōu)化方案（浸泡時間６ ｈ，提取時間２０ ｍｉｎ，提取溫度３５ ℃，有機溶劑選用７０％的乙醇）提取天門冬塊根，所得提取液分別對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黑曲霉進行最小抑菌濃度測定，結果如表５所示。天門冬提取液對金黃色葡萄球菌的ＭＩＣ為３．１３ ｍｇ／ｍＬ；對大腸桿菌的ＭＩＣ為６．２５ ｍｇ／ｍＬ；對黑曲霉的ＭＩＣ為１２．５０ ｍｇ／ｍＬ。因此，天門冬提取液對３種菌的抑制效果依次為：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉。

３討論

目前，中藥的提取方法有水煎法、醇提取法、微波提取法、超聲波法、超臨界ＣＯ２流體萃取法等［11］。本試驗利用水煎法、醇提取法和超聲波提取法制備天門冬提取液，考察不同提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黑曲霉的抑菌效果。結果顯示，在浸泡時間６ ｈ，提取時間２０ ｍｉｎ，提取溫度３５ ℃，有機溶劑選用７０％乙醇的條件下所得提取液的抑菌效果最好。從試驗操作和抑菌效果兩方面綜合評價３種方法，則超聲波提取法最好，醇提取法次之，水煎法效果最差，因為超聲波提取法操作簡便，便于優(yōu)化，效果好，而醇提取法和水煎法易受人為操作影響，如溫度和火候控制不好，對試驗結果會造成很大的影響。另外醇提取法和水煎法所用溫度較高，有可能破壞天門冬提取液中的抑菌物質(zhì)。

此外，在超聲波提取法中，有機溶劑對抑菌效果的影響最顯著，提取效果為７０％乙醇最好，９０％乙醇次之，石油醚較差，由此可見天門冬塊根中的抑菌有效成分多能溶于極性較大的有機溶劑中，而溶于石油醚等極性較小的有機溶劑中的成分較少。綜合醇提取法和超聲波提取法的結果可以看出，不同濃度的乙醇所得提取液的抑菌效果也有差別。

天門冬塊根中含天冬酰胺及谷氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、瓜氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸等１９種氨基酸，還含有β－谷甾醇、甾體皂苷、黏液質(zhì)、寡糖、多糖、糠醛衍生物等成分［１］。根據(jù)所用有機溶劑的提取效果，天門冬塊根中抑菌成分可能為氨基酸、多糖、β－谷甾醇、甾體皂苷等物質(zhì)。雖然天門冬有效抑菌物質(zhì)的具體成分尚不清楚，其分離純化有待進一步研究，但是天門冬抑菌成分的提取方法操作步驟簡單、溶劑消耗量少、提取時間短、抑菌效果好、生產(chǎn)成本低，開發(fā)生產(chǎn)天門冬抑菌洗化用品將會逐步走向產(chǎn)業(yè)化。

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