黃曲霉毒素M₁(AflatOxin M1，AFMD是黃曲霉毒素中一種二氫呋喃雜萘鄰?fù)苌?，主要是由于奶牛食用了被黃曲霉毒素B1(Aflatoxln B1，AFBI)污染的飼料后，AFB，在奶牛體內(nèi)代謝產(chǎn)生的羥基化代謝物，轉(zhuǎn)化反應(yīng)式如圖1。AFMM₁毒性強(qiáng)、對(duì)人體危害大，1993年WHO將AFM，歸為對(duì)人類||類致癌物，其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，主要危害的部位在肝臟。

AFM₁很難降解，其熔點(diǎn)(裂解溫度)為299℃對(duì)光、熱和酸都比較穩(wěn)定。牛奶加工常用的三種熱處理方法

巴氏殺菌法(LTLT，63℃保持30min)、高溫快速巴氏殺菌(HTST，72℃保持15s)和超高溫滅菌(UHT，135℃保持1～2s)均不能破壞其毒性。因此，生鮮乳中存在的AFM₁會(huì)導(dǎo)致乳制品中也含有AFM₁。許多國(guó)家、國(guó)際組織依據(jù)本國(guó)國(guó)情制定了牛奶中AFM₁的限量標(biāo)準(zhǔn)，并就AFM₁的檢測(cè)方法開(kāi)展了許多研究工作。本文對(duì)不同國(guó)家、國(guó)際組織對(duì)牛奶中AFM₁限量值進(jìn)行了比對(duì)分析，并重點(diǎn)對(duì)其檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述，以期對(duì)我國(guó)奶業(yè)生產(chǎn)者和政府監(jiān)管部門(mén)起到定借鑒作用，切實(shí)保證我國(guó)牛奶中的AFM₁安全。牛奶中AFM₁的限量

AFM₁限量的確定是法律法規(guī)制定和風(fēng)險(xiǎn)控制的關(guān)鍵內(nèi)容。牛奶中AFM₁限量取決于科學(xué)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)方面的諸多因素，主要包括危害分析、暴露分析結(jié)果、抽樣方案和方法、分析方法、貿(mào)易協(xié)調(diào)、國(guó)內(nèi)食品供應(yīng)6因素。這些因素都能制約AFM₁限量值的確定，其中危害分析和暴露分析是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估內(nèi)容，是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中最重要的部分：抽樣方案、方法和分析方法是確定限量值的實(shí)驗(yàn)手段，是獲得真實(shí)數(shù)據(jù)的保證：貿(mào)易協(xié)調(diào)和國(guó)內(nèi)食品供應(yīng)是社會(huì)經(jīng)濟(jì)因素。這些因素相互影響。制約，綜合地決定牛奶中AFM，限量值。

截至2004年底，已有60個(gè)國(guó)家制定了AFM₁的限量值。牛奶中AFM₁限量值采用0.05g／kg的國(guó)家最多，為34個(gè)其中絕大部分國(guó)家是歐盟成員國(guó)以及與歐盟有貿(mào)易的非洲、亞洲、拉丁美洲部分國(guó)家，歐盟對(duì)嬰幼兒配方食品，包括嬰幼兒配方牛奶限量0.025ug／kg。另個(gè)限量值為0.5ug／kg，有22個(gè)國(guó)家，包括美國(guó)、中國(guó)以及若干亞洲和歐洲國(guó)家。還有4個(gè)國(guó)家分別采用15、5、0.2“g／kg以及不得檢出。一些主要國(guó)家牛奶中AFMI的限量標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。飼料中黃曲霉毒素含量過(guò)高。發(fā)霉的谷物作為飼料飼喂奶牛后，24小時(shí)后便可在奶中檢出AFM₁。由于飼料原料很容易出現(xiàn)黃曲霉毒素污染，尤其是玉米和花生，因此目前各個(gè)國(guó)家對(duì)飼料中的黃曲霉毒素B₁，以及牛奶中的黃曲霉毒素M₁都有所限量，卻不能要求完全不可檢出。黃曲霉毒素被奶牛食用后，一部分會(huì)蓄積在動(dòng)物的體內(nèi)，另一部分則會(huì)轉(zhuǎn)化到乳汁和尿液中。因此，為了保證牛奶中的黃曲霉毒素M₁不超過(guò)0.5g／kg，美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)規(guī)定飼料中的黃曲霉毒素B₁不得超過(guò)30g／kg。我國(guó)GB 13078-2001《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)飼料中的黃曲霉毒素B，限量也有著嚴(yán)格要求，見(jiàn)表2。

牛奶中AFM₁的檢測(cè)方法

牛奶中A FM₁的檢測(cè)程序

般包括樣品的制備、AFM₁的提取、提取物的凈化和最終的定性、定量測(cè)定。牛奶中AFM₁的定量定性分析方法主要有薄層色譜分析法(ThinLayer Ch romatog raphy,TLC)、高效液相色譜法(High Performance LiquidChromatography,HPLC)、液相色譜質(zhì)譜法(Liquid Chromatog raphy with MassSpectrometry，LC MS)和快速法。

1TLC法

TLC法是通過(guò)肉眼比較定性或者半定量的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，AFMI在波長(zhǎng)365nm的紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光的最低檢出量與標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度相比較來(lái)測(cè)定含量。

TLC法是牛奶中黃曲霉毒素M，測(cè)定的官方規(guī)定方法之，GB 5009，242010食品中黃曲霉毒素M1和B，的測(cè)定、ISO 14674：2005(1DF 190：2005)牛奶和奶粉黃曲霉毒素M₁的測(cè)定、AOAC974.17乳制品中黃曲霉毒素M₁的測(cè)定和AOAC 980 21牛奶和奶酪黃曲霉毒素M₁的測(cè)定就是TLC法。隨著HPLC和LC-MS的發(fā)展，TLc應(yīng)用程度有所下降，但由于其不依賴特殊儀器，成本低、操作簡(jiǎn)單快速，仍被用于大規(guī)模的篩查研究中。

2HPLC法

HPLC法利用免疫親和柱或C1 8柱凈化后，HPLC串聯(lián)不同檢測(cè)器，如熒光(Fluo rescence Detection，F(xiàn)LD)、質(zhì)譜(MassSpectrometry，MS)等的定量測(cè)定被廣泛用于牛奶中AFM₁的檢測(cè)。

(1)HPLCFLD

用c18柱抽提純化樣品中的AFM，乙醚對(duì)c18柱洗滌，再用CH2C12醇洗脫AFM₁，然后加入三氟乙酸(TFA)對(duì)AFMI進(jìn)行衍生化處理，利用液相色譜熒光檢測(cè)器檢測(cè)，并與標(biāo)準(zhǔn)AFM₁-TFA的衍生物比較，進(jìn)行定性、定量分析。此法利用了牛奶中AFM，具有較強(qiáng)的發(fā)射熒光特性，具有靈敏性高、選擇性強(qiáng)、價(jià)格經(jīng)濟(jì)、易于操作優(yōu)點(diǎn)。我國(guó)GB 5413 37201 0乳和乳制品中黃曲霉毒素M，的測(cè)定(第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法)、GB／T 2321 2 2008牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B、G1、G、M1和M：的測(cè)定，XAOAC 2000，。8液態(tài)奶黃曲霉毒素M1含量的測(cè)定采用的就是LC FLD或HPLC FLD法。

(2)HPLC MS

由于AFMl的分離和檢測(cè)條件致，電噴射(Efficient_lectrospray，ESl)、大氣壓化學(xué)電離(Atmospheric PressureChemical lonlzatlon，APCI)等技術(shù)應(yīng)用于LC MS，質(zhì)譜分析儀器領(lǐng)域的發(fā)展等

原因，MS檢測(cè)器具有更高的選擇性、對(duì)分析物分子標(biāo)識(shí)的確證、可用同位素標(biāo)記作為內(nèi)標(biāo)等優(yōu)勢(shì)，HPLC MS廣泛應(yīng)用于AFM1的檢測(cè)中。ISO 14501：2007IDF171：2007)牛奶和奶粉黃曲霉毒素M1含量的測(cè)定和我國(guó)GB 5413.37-201 乳和乳制品中黃曲霉毒素M，的測(cè)定(第法免疫親和層析凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法)采用的就LC MS法檢測(cè)奶中的黃曲霉毒素M₁。

3

快速法

快速法又稱掃描法，是定性或半定量方法。定性的閾值是限量值，各國(guó)不同?，F(xiàn)場(chǎng)快速的檢測(cè)對(duì)于質(zhì)量安全監(jiān)管具有重要的意義。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme Linked lmmuno SorbentAssay，剛SA)、單克隆抗體試劑盒法、雙流向酶聯(lián)免疫吸附法(SNAP)、膠體盒法等半定量技術(shù)無(wú)需對(duì)牛奶進(jìn)行前處理，檢測(cè)時(shí)間短、操作方法簡(jiǎn)單且不依賴于任何儀器，被廣泛地應(yīng)用于牛奶，尤其是生乳的檢測(cè)中。

(1)ELISA法

ELISA法原理是：樣品中的AFMI與定量特異性抗體反應(yīng)，多余的游離抗體與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，加入酶標(biāo)記物和底物后顯色，與標(biāo)準(zhǔn)比較來(lái)測(cè)定含量。該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)操作污染少，一次實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)多個(gè)樣品。該方法靈敏度高、易操作，可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

對(duì)于乳及乳制品中AFMl的檢測(cè)，我國(guó)DB33／T 556 2005乳和乳粉中黃曲霉毒素M₁的測(cè)定使用酶聯(lián)免疫吸附法和ISO 14675：2003(1DFl86：2003)牛奶和牛奶制品競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)化描述指南黃曲霉毒素M，含量的測(cè)定即為ELISA法。

(2)單克隆抗體試劑盒法

單克隆抗體試劑盒是一種建立在以單克隆抗體技術(shù)與ELISA技術(shù)的基礎(chǔ)上，針對(duì)原料奶中黃曲霉毒素M₁，的快速檢測(cè)的試劑盒，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。

(3)膠體金法

此法基于競(jìng)爭(zhēng)法膠體金免疫層析技術(shù)，用于快速篩查含有AFM₁的液態(tài)奶、奶粉(含嬰兒奶粉)和飼料等樣品。將檢測(cè)樣品液加入速測(cè)卡上的樣品孔，檢測(cè)液中的AFM₁與金標(biāo)卡上的金標(biāo)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，若AFM₁在檢測(cè)液中濃度低于設(shè)定檢測(cè)靈敏度值(陰性樣本)，未結(jié)合的金標(biāo)抗體流到T區(qū)時(shí)，被固定在膜上的抗原捕獲，形成條可見(jiàn)的T線；若AFM，濃度高于設(shè)定檢測(cè)靈敏度值，金標(biāo)抗體即與AFMl全部形成復(fù)合物，不再與T線處抗原結(jié)合，T線不可見(jiàn)。C線為質(zhì)控線，出現(xiàn)則說(shuō)明該速測(cè)卡有效。

(4)SNAP法

利用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)原理，樣品中殘留的黃曲霉毒素M₁與定量特異性酶標(biāo)抗體反應(yīng)，多余的游離酶標(biāo)抗體則與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，通過(guò)流動(dòng)洗滌，加入酶顯色底物顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)比較定性。GB 5413.372010乳和乳制品中黃曲霉毒素M₁的測(cè)定(第四法)和NY 1664-2008牛乳中黃曲霉毒素M₁的測(cè)定均采用此法?？偨Y(jié)

近年來(lái)，由于多級(jí)質(zhì)譜(Multistage Mass Spectrometry，MS)的發(fā)展，HPLC-MS／MS法可對(duì)牛奶中多種霉菌毒素同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，且無(wú)須衍生化。該法預(yù)處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中多組分霉菌毒素的確認(rèn)和準(zhǔn)確定量檢測(cè)。此外，乳及乳制品特別是生乳的貯存條件特殊，不宜長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸貯存，快速檢測(cè)對(duì)大規(guī)模監(jiān)測(cè)具有重要意義。同時(shí)，快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)可以提高檢測(cè)效率，加大監(jiān)測(cè)范圍和力度，保證牛奶質(zhì)量安全。但快速法篩選出的陽(yáng)性或超標(biāo)樣品需要HPLC法、HPLC-MS法等定量法的進(jìn)

步確證。

(基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)國(guó)際合作與交流項(xiàng)目資助；通訊作者：鄭楠)