張廷婷　谷曉紅　李春娟　王春瑋　閆彩霞　單世華

摘 要：為研究殼聚糖包衣對(duì)提高花生抗性的作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)用殼聚糖溶液（Chitosan Solution，CS）對(duì)不同品種花生種子包衣，測(cè)定在萌發(fā)階段花生種子內(nèi)的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）等主要防御酶活性的變化。結(jié)果表明，殼聚糖可明顯提高花生種子PAL、PPO、POD的活性，并且不同濃度的殼聚糖溶液包衣促進(jìn)效果不同，各品種最適合的殼聚糖濃度也不同。表明外源殼聚糖處理可使花生種子防御酶活性增加，增強(qiáng)花生抗病性。

關(guān)鍵詞：花生；殼聚糖；防御酶

中圖分類號(hào)：S565.201 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2012）11-0031-04

Effect of Chitosan Cover on Activities of Defense Enzymes

in Peanut （Arachis hypogaea L.） Seeds

Zhang TingTing1， Gu XiaoHong2， Li ChunJuan1， Wang ChunWei1，3， Yan CaiXia1， Shan ShiHua1*

（1. Shandong Peanut Research Institute， Qingdao 266100， China； 2.Central Laboratory of Shandong Academy of

Agricultural Sciences， Jinan 250100， China； 3. Shandong University at Weihai， Weihai 264209， China）

Abstract In order to study the mechanisms of chitosan cover on increasing the resistance of peanut， different cultivars of peanut seeds were covered with chitosan solution， and then the activity variation of PAL， PPO and POD were determined and analyzed during the germination period. The results showed that the activities of these three enzymes in peanut seeds increased significantly after treated with chitosan. The effect was different with different concentrations of chitosan， and the optimal chitosan concentration for different peanut cultivars was also different. In conclusion， chitosan could increase the activities of defense enzymes in peanut seeds， and then increased the peanut resistance to diseases.

Key words Peanut （Arachis hypogaea L.）； Chitosan； Defense enzyme

殼聚糖（Chitosan，CTS）是天然聚合物，在自然界廣泛存在，將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不會(huì)產(chǎn)生任何毒副作用，在土壤中經(jīng)微生物分解后的最終產(chǎn)物又可被植物吸收，對(duì)土壤微環(huán)境不會(huì)造成不利影響，美國(guó)、日本、加拿大等國(guó)己有不少報(bào)道，國(guó)內(nèi)近幾年相關(guān)報(bào)道也逐漸增多。CTS作為生防農(nóng)藥，可以制成浸種劑、根施劑、噴霧劑、展膜劑等，在抗病誘導(dǎo)、殺菌殺蟲(chóng)、抵御逆境等方面扮演著日益重要的角色[1]，在作物生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景[2，3]。

Hadwiger等[4]認(rèn)為，在植物病原菌與寄生植物之間，CTS對(duì)植物病原菌的孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)有阻礙作用，并對(duì)病原菌感染的防護(hù)機(jī)能具有誘導(dǎo)作用。趙蕾等[5]研究表明，CTS除了對(duì)煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）有抑制作用外，還能誘導(dǎo)煙草植株的抗病性，誘導(dǎo)效應(yīng)可達(dá)10%～7856%。 殼聚糖包衣還可以改變植物的酚類代謝，Ralph[6]證實(shí)，殼聚糖誘導(dǎo)的大豆細(xì)胞中酚類組成會(huì)迅速變化，如苯丙烷、香豆酸和綠原酸等都明顯增加。殼聚糖對(duì)過(guò)氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）也有影響，張燕等[7]用03%～05%的殼聚糖對(duì)煙草種子進(jìn)行浸種處理，發(fā)現(xiàn)處理組的幼苗葉片POD活性均高于對(duì)照組（未經(jīng)殼聚糖處理）。部分乙酰化的殼聚糖多聚體可強(qiáng)烈誘導(dǎo)小麥葉片PAL和PPO的活性[8]。PPO和PAL等酶類在植物的抗病反應(yīng)中起著十分重要的作用[9]。

本研究通過(guò)利用不同濃度的殼聚糖溶液（Chitosan Solution，CS）浸泡花生種子，選用引自印度的抗逆性強(qiáng)的花生品種J11、北方花生產(chǎn)區(qū)主推品種花育22號(hào)以及南方花生產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)品種仲愷花11號(hào)為試驗(yàn)材料，測(cè)定包衣后花生種子中與抗性密切相關(guān)的三種防御酶活性變化，旨在闡明CS包衣后花生抗性增強(qiáng)的生理機(jī)制，為生產(chǎn)中花生抗逆及相關(guān)病害防治和抗性育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

11 供試材料

花生品種J11、花育22、仲愷花11號(hào)由山東省花生研究所品種資源課題組保存。

所用試劑包括殼聚糖、液氮、硼酸緩沖液（內(nèi)含5 mmol/L的巰基乙醇，pH 88）、鹽酸、L-苯丙氨酸、醋酸、鄰甲氧基苯酚、鄰苯二酚、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、甲硫氨酸（Met）、四氮唑藍(lán)（NBT）、核黃素（FD）、過(guò)氧化氫（30%）、氫氧化鈉、三氯乙酸、乙醇。

儀器包括高速冷凍離心機(jī)、電子天平、FA/JA系列電子天平、雙向磁力加熱攪拌器、pH計(jì)、快速混勻器、智能型交流凈化穩(wěn)壓電源、光照培養(yǎng)箱、超低溫保存冰箱、冰柜、氣浴恒溫振蕩器、電熱恒溫水浴鍋、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱。

12 試驗(yàn)方法

每品種各取種子50粒浸泡于70%的酒精中10 min，取出后用01%HgCl2洗滌3遍，每次1 min，再加無(wú)菌水浸泡4 h。然后分別用0、01、05、10、15 g/L的CS溶液進(jìn)行浸泡包衣處理，1 h后取出晾干，在超凈工作臺(tái)上立即接種于MS0培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光照2 400 lx。每天取出樣本進(jìn)行酶活力檢測(cè)。

13 酶活性測(cè)定

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性用苯丙氨酸法[10]，過(guò)氧化物酶（POD）活性用愈創(chuàng)木酚法[11]，多酚氧化酶（PPO）活性用紫外分光光度法測(cè)定[12]。每樣品重復(fù)5次，取平均值。

14 酶活單位及計(jì)算

以每分鐘內(nèi)OD值變化001為一個(gè)酶活單位，按下式計(jì)算酶活力：

酶活力（001△OD/min）=（△OD/001t）×D

式中△OD為反應(yīng)內(nèi)光密度的變化；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；D為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

21 CS對(duì)花生種子PAL活性影響

從圖1看出，不同品種花生種子經(jīng)不同濃度CS處理后，發(fā)芽期間PAL活性在5天內(nèi)變化較明顯。經(jīng)不同濃度CS處理后，仲愷花11號(hào)花生種子的PAL活性提高顯著，在測(cè)定時(shí)間范圍內(nèi)出現(xiàn)明顯的峰值，其中05 g/L濃度CS處理后第3天PAL活性提高到最大值，且比對(duì)照組高6214%。花育22號(hào)在測(cè)定時(shí)間范圍內(nèi)也出現(xiàn)峰值，然后緩慢下降，最佳的處理濃度在01 g/L左右。J11花生種子PAL活力變化總體較平穩(wěn)，其中濃度為01 g/L的CS處理后第1天對(duì)種子PAL活性促進(jìn)作用較大，隨后有所下降，在第4天時(shí)略有提高，然后又下降，總的來(lái)說(shuō)CS處理對(duì)J11的PAL活性影響不是很大。

22 CS對(duì)花生種子POD活性影響

經(jīng)不同濃度CS包衣處理之后（圖2）， 不同品種花生種子內(nèi)POD活性均有不同程度提高，三個(gè)品種的總體趨勢(shì)均為先上升后下降。仲愷花11號(hào)在CS濃度為1.0 g/L時(shí)相對(duì)于對(duì)照組酶活性提高最明顯，在第4天時(shí)的提高程度最大，且比對(duì)照高2.14倍?；ㄓ?2號(hào)在CS濃度為01 g/L處理后POD活性變化差異較大，在第3天時(shí)達(dá)49333 U/（min·gFW），比對(duì)照高2.96倍。J11種子在CS處理后第2天，POD活性促進(jìn)作用提高較大，在第4天時(shí)各處理濃度的POD活性達(dá)到最大，其中CS濃度為01 g/L時(shí)最高，比對(duì)照高2749%。

注：A，仲愷花11號(hào)；B，花育22；C，J11，下圖同。

圖1 不同濃度CS處理對(duì)花生PAL活性的影響

圖2 不同濃度CS處理對(duì)花生POD活性影響

23 CS對(duì)花生種子PPO活性的影響

經(jīng)不同濃度CS包衣處理之后（圖3），各花生品種的PPO活性也有不同程度的變化。仲愷花11號(hào)PPO活性變化較明顯，呈先升高后降低的趨勢(shì)，其中1 g/L的CS處理后，第3天PPO活性提高最大，比對(duì)照高2倍?；ㄓ?2經(jīng)過(guò)CS處理后，PPO活性在不同濃度不同時(shí)間變化趨勢(shì)不一致，總體來(lái)說(shuō)，01 g/L CS處理最大程度地提高了PPO活性；J11經(jīng)不同濃度CS處理后PPO活性變化也呈先升高后降低的趨勢(shì)，以 01 g/L的CS處理酶促進(jìn)作用較顯著，在第2天時(shí)提高到最大，比對(duì)照高263%。

圖3 不同濃度CS處理對(duì)花生PPO活性的影響3 討論

花生受病原菌誘導(dǎo)后會(huì)激活部分防御酶，包括PAL、POD、PPO等，其中PAL參與植保素和木質(zhì)素的合成，POD可催化木質(zhì)素前體脫氫氧化，木質(zhì)素能夠提高細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度和鈍化細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶，阻止病原菌侵入擴(kuò)散。POD還是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源性活性氧的清除劑。PPO與底物接觸，將酚氧化成為棕褐色的醌，后者對(duì)病原菌的毒殺能力比較強(qiáng)。

殼聚糖不僅能夠抑制多種病原菌的菌絲生長(zhǎng)，而且還參與到植物的多種抗病性反應(yīng)，如幾丁質(zhì)酶的積累[13]、誘導(dǎo)葡聚糖酶的合成[14]以及誘導(dǎo)PAL活性[15]等，從而激發(fā)苯丙烷類代謝，產(chǎn)生酚類和異黃酮類抗毒素作用；誘導(dǎo)產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白（pathogenesis related proteins，PR蛋白）[5，6，16]。此外，殼聚糖等甲殼素衍生物對(duì)許多植物病原真菌有一定程度的直接抑制作用[8]。殼聚糖本身的成膜性也阻礙了病原菌與寄主組織或細(xì)胞的直接接觸，減少了病原菌的有效侵入。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，用適宜濃度的殼聚糖溶液（CS）包衣花生種子，在一定程度上會(huì)提高花生自身PAL、POD、PPO等酶的活性，從而提高植物自身抗病性，對(duì)農(nóng)作物提高抗性具有重要的實(shí)踐意義。參 考 文 獻(xiàn)：

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