申永梅 楊紀(jì)君 霍曉輝 田東方 曹雪松

摘要：總結(jié)了RNA 沉默及病毒RNA 沉默抑制因子(VSRs)的研究進(jìn)展，以及病毒基因沉默抑制因子利用甘氨酸/ 色氨酸(GW) 模型作為ARGONAUTE(AGO) 鉤和寄主發(fā)生RNA 沉默的重要作用部位相互結(jié)合從而抑制基因沉默的研究機(jī)制。通過研究發(fā)現(xiàn)，在酵母、動植物細(xì)胞中，一些包含GW 模型的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是RNA 沉默效應(yīng)復(fù)合物中AGOs 的重要協(xié)助者。結(jié)果說明，GW 模型是一種能用于調(diào)節(jié)RNA 沉默途徑活性的萬能的、有效的工具，用GW 模型競爭性結(jié)合AGOs 并抑制寄主基因沉默可能是一種被許多病原菌用于抵抗寄主RNA 沉默的方法。

關(guān)鍵詞： RNA 沉默； VSRs； AGO 蛋白； GW 模型

中圖分類號： Q74 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.01.006

Evolution of Restraining Host RNA Silencing by Binding of Viral Suppressor Protein and Argonautes

SHEN Yong-mei1, YANG Ji-jun1, HUO Xiao-hui1, TIAN Dong-fang2, CAO Xue-song1

（1.College of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng, Shandong 252059, China;2. Shandong Provincial Committee School,Jinan ,Shandong 250103,China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ:This paper summed up the evolution of RNA silence and viral suppressors of RNA silencing (VSRs) ,and viral suppressors of RNA silencing use glycine/ tryptophane (GW) motifs as an ARGONAUTE (AGO) hook inhibit gene silence by binding the important location of RNA silence. Through the study we found that, in yeast, animal and plant cells, some protein containing GW motifs was considered to be important partners of AGOs in RNA silencing effector complexes.The result indicated the GW motif seemed to be a universal and effective tool for regulating the activities of RNA silencing way, and many pathogens may use the method of GW motif competing for and restraining host AGOs to counteract host RNAi-based defenses.

Key words: RNA silencing; VSRs; argonaute protein; GW motifes

RNA 沉默是廣泛存在于真核生物中的調(diào)控基因表達(dá)的保守機(jī)制，其作用是調(diào)控多種生物學(xué)功能，包括維持基因組的完整性、發(fā)育過程中基因的調(diào)控、控制多種生理活性和對外界各種非生物及生物刺激的響應(yīng)等，特別是抗病毒反應(yīng)[1]。這一現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)距今20 a，對其機(jī)制的研究到現(xiàn)在也僅10 a，可是它的出現(xiàn)揭示出生命另一種基因表達(dá)調(diào)控方式，改變了人們原本認(rèn)為非編碼RNA 在體內(nèi)不起關(guān)鍵作用的看法，也迅速成為人們研究的熱點(diǎn)。隨著2006 年諾貝爾獎?wù)绞谟柽@一領(lǐng)域的研究成果，該領(lǐng)域的進(jìn)展更是日新月異。通過對RNA 沉默機(jī)制的研究，人們發(fā)現(xiàn)了由不同小RNA 介導(dǎo)的RNA 沉默途徑，并鑒定了一系列參與RNA 沉默途徑的關(guān)鍵蛋白。其中， RISC 核心成分AGO 蛋白( argonaute proteins) 日益成為人們研究的焦點(diǎn)。AGO 蛋白是RNA 沉默路徑中的一個關(guān)鍵蛋白，它與小RNA 的引導(dǎo)鏈及其他蛋白組裝成RISC ，在植物中共同參與維持基因組的穩(wěn)定、調(diào)控組織發(fā)育、對逆境的適應(yīng)性應(yīng)答以及在RNA 層面對入侵核酸(轉(zhuǎn)基因和植物病毒) 的免疫。近來的研究發(fā)現(xiàn)了另一類與AGO 蛋白結(jié)合并在基因沉默中發(fā)揮作用的蛋白，這類蛋白序列中含有重復(fù)的甘氨酸、色氨酸(GW/WG repeats or GW motif)，廣泛存在于酵母、植物和動物細(xì)胞中，序列中GW/WG 重復(fù)2次至多次，并且是與AGO 相互作用的關(guān)鍵氨基酸，因而稱為“AGO 鉤”(Ago hook)。蛋白質(zhì)序列中GW/WG 重復(fù)可能是與AGO 蛋白相互作用的進(jìn)化保守序列及關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，能用于調(diào)節(jié)活動的RNA 沉默途徑，用GW 模型競爭和抑制寄主AGOs 可能是一種被許多病原菌用于抵抗寄主RNA 沉默的方法。

1病毒利用病毒RNA 沉默抑制因子（VSRs） 抵抗寄主以RNA沉默為基礎(chǔ)的抗病毒能力

真核生物在長期進(jìn)化過程中獲得了“分子免疫的預(yù)警系統(tǒng)”，能夠檢測到細(xì)胞中的雙鏈RNA(dsRNA) ，dsRNA是引起RNA沉默的“激發(fā)分子”，dsRNA可來源于病毒基因組的復(fù)制中間體、真核生物體內(nèi)miRNA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的自我配對以及人為引入反向互補(bǔ)DNA的轉(zhuǎn)錄本等。dsRNA產(chǎn)生后，RNA酶III類(RNase III) 的Dicer酶(植物中稱為類似DICER，DICER-LIKE，DCL) 識別并結(jié)合到dsRNA 上，并切割dsRNA 成21~24 nt 的小干涉RNA(small interfering RNA，siRNA) 。初始siRNA 產(chǎn)生后經(jīng)宿主的“依賴于RNA的RNA聚合酶(RDR)”擴(kuò)增并被DICER 切割產(chǎn)生大量次級siRNA，并可作為系統(tǒng)RNA 沉默信號，經(jīng)植物的胞間聯(lián)絲和韌皮部傳播到其他組織和細(xì)胞，引起系統(tǒng)RNA 沉默，為抵消這種寄主防御方式，病毒產(chǎn)生蛋白質(zhì)來抑制RNA 沉默[2] 。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的植物病毒屬和一些動物病毒中都有VSRs 。它們的序列極其多樣，并含有ORFs 或與其他保守病毒基因交叉重疊。我們已經(jīng)知道50多種VSRs，除了在病毒的復(fù)制、折疊、運(yùn)動、發(fā)病機(jī)理過程中起重要的作用之外還能抑制寄主以RNA 沉默為基礎(chǔ)的基因沉默[3] 。盡管 VSRs抑制RNA 沉默的作用機(jī)制呈現(xiàn)多樣性，即作用于RNA 沉默路徑中的靶位點(diǎn)不同，但其作用方式基本上可以分為2種類型。一種是通過和dsRNA 結(jié)合防止了小RNA 和AGO 蛋白結(jié)合產(chǎn)生RISC ，減少或抑制siRNA 的產(chǎn)生從而抑制RNA 沉默。這些結(jié)合dsRNA 的VSRs有著不同的序列和結(jié)構(gòu)。研究得最清楚的例子是來自植物番茄叢矮病毒的P19蛋白，P19和蕪箐花葉病毒(TuMV) 的P1/HC-Pro 蛋白具有阻斷HEN1 對小RNA 的甲基化作用，導(dǎo)致siRNA 因缺少末端甲基化保護(hù)而易于降解[4-5] 。黃瓜花葉病毒(CMV) 編碼的2b 蛋白及花椰菜花葉病毒(CaMV) 編碼的P6蛋白是通過直接或間接干擾DCL而抑制RNA沉默 [6-7]。然而P19 和2b 蛋白代表的是一類結(jié)合小RNA具有特定長度的病毒RNA 沉默抑制因子，一些其他病毒RNA 沉默抑制因子，如來自植物線性病毒組的P21 蛋白[5] 及來自昆蟲Flockhouse 病毒 (FHV) 的B2[ 8-9] 能單獨(dú)結(jié)合dsRNAs從而抑制基因沉默。

另一個作用機(jī)制是通過和RNA 沉默途徑中的某些蛋白相互作用來抑制RNA 沉默。作為一個已知的RNA 沉默過程中的結(jié)合蛋白，AGO 很容易成為基因沉默抑制因子的作用目標(biāo)。已有報(bào)道，黃瓜花葉病毒(CMV) 的2b 蛋白可以和AGO1 的PAZ 結(jié)構(gòu)域相互作用抑制RISC 活性[10] 。馬鈴薯卷葉病毒屬的P0 蛋白包含一個小F-box，通過F-box 與泛素降解途徑與SCF 家族中的SKP1 相互作用而導(dǎo)致AGO1 的降解 [11-12] 。進(jìn)一步的研究表明P0 與AGO1 的結(jié)合發(fā)生在AGO1 與siRNA 組裝成RISC 復(fù)合體之前[3] 。

2GW 模型——新的抑制寄主RNA 沉默方式

盡管最近幾年人們對基因沉默抑制因子在基因和物理機(jī)制鑒定方面的研究已經(jīng)很深，但是我們對許多抑制因子功能方面的分子機(jī)制仍然不甚了解。Azevedo 等[2] 的報(bào)道填補(bǔ)了這一空缺。他們發(fā)現(xiàn)蘿卜皺病毒(TCV) 的P38 外殼蛋白，作為一個眾多周知的抑制因子通過一種新的機(jī)制抑制RNA 沉默。擬南芥編碼多個DCL，已鑒定了其中的4個DCL 功能，不同的DCL 具有不同的功能。其中DCL4 和DCL2 具有協(xié)同抗病毒的作用，DCL4 是主要的識別和作用成分，其作用產(chǎn)生21 nt 的病毒siRNA，當(dāng)DCL4 功能減弱或受阻后，則由DCL2 補(bǔ)償發(fā)生作用，并產(chǎn)生22 nt 的病毒siRNA。已有遺傳證據(jù)表明P38 能抑制DCL4 的功能[13] ，但Azevedo 等人發(fā)現(xiàn)缺失P38 的TCV 能成功地侵染dcl2-dcl4 雙重突變而不是dcl4 單一突變，這表明P38 也可以抑制由DCL2 誘導(dǎo)的抗病毒沉默。P38 與AGO 的相互作用影響了DCL 的表達(dá)， DCL2 產(chǎn)生的22 nt 大小的viRNAs 可以優(yōu)先和AGO1 結(jié)合， Azevedo 等[2] 猜測P38 能抑制AGO1 的功能。結(jié)果他們的猜測通過在侵染植物中和AGO1 共免疫沉淀所證實(shí)。更重要的是，他們發(fā)現(xiàn)P38 的N 端和C 端包含兩個GW，而GW 是一個AGO 結(jié)合區(qū)域，能被一些細(xì)胞內(nèi)蛋白所利用。GW 的N 端是保守的，存在于幾乎所有的香石竹斑駁病毒屬成員的P38 蛋白中，而其C 端只存在于TCV 的P38 蛋白。P38 在N 端和C 端的其中的一端或者兩端發(fā)生點(diǎn)突變，由GW 變成GA，這個點(diǎn)突變就會使P38 失去結(jié)合AGO1 的活性，同時(shí)也失去了在煙草葉子瞬時(shí)表達(dá)中抑制基因沉默的能力，這表明了GW 在P38 具有的功能中起著重要作用。如果使P38 有兩個GW->GA 點(diǎn)突變，攜帶這個突變體的TCV(TCVGA2) 不能侵染野生型植株，但是能侵染ago1 突變植株。這些結(jié)果說明了P38 的GW 重復(fù)不僅在調(diào)節(jié)與AGO1 相互作用方面也在依賴于AGO1 的RNA 沉默過程中起著重要作用。

細(xì)胞中的miRNA 平衡對AGO1 功能的抑制作用也有著重要作用。比如，在TCV 侵染的植物中，依賴于P38 抑制基因沉默的方式降低了以DCL1 為目標(biāo)的miR162 的水平。因此，在TCV 侵染的植物中DCL1 蛋白含量急劇增加，DCL3 和DCL4 水平下降，這可能是DCLs 和DCL1 兩者對抗的結(jié)果。

包含GW 模型的P38 和AGO1 的結(jié)合模擬了一些細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合AGOs，是RISC的組成部分。這些細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)已經(jīng)確定來自酵母、植物和動物，并含有2~40個GW/WG 重復(fù)單元。GW/WG 重復(fù)單元作為AGO 鉤，與AGO 相互結(jié)合，對轉(zhuǎn)錄中基因沉默(TGS) 和轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS) 有重要的作用。如酵母的Tas3蛋白包含2個GW/WG 重復(fù)，Tas3與AGO1 結(jié)合，并與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferase) Clr4 共同形成轉(zhuǎn)錄沉默復(fù)合體(transcriptional silencing complex，RITS) [14-18] 。在后生動物中廣泛存在的GW182蛋白家族序列中包含多個GW/WG 重復(fù)，GW182 與AGO 蛋白結(jié)合并存在于mRNA 代謝體(Processing body，P-body或稱為GW－body) 中，參與miRNA 介導(dǎo)的基因沉默[2,19] 。擬南芥中依賴于DNA 的RNA 聚合酶V(PolV) 大亞基NRPE1 序列中的C 端含有21個GW/WG 重復(fù)，通過該重復(fù)與AGO4 相互作用并引起RNA 介導(dǎo)的DNA 甲基化，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄基因沉默[20] 。PolV 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為不含有“帽子”和PolyA “尾巴”結(jié)構(gòu)的RNA，這種RNA 作為分子伴侶(scaffold molecules) 協(xié)助siRNA 的AGO4 作用于與之配對的DNA 同源區(qū)，并通過DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶DRM2 產(chǎn)生新的DNA 甲基化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默[21] 。另一個包含GW/WG 的蛋白KTF1 與轉(zhuǎn)錄延伸因子SPT5 同源，在植物RdDM 途徑的不同步驟中，作為受體蛋白與AGO4 結(jié)合并發(fā)揮作用[22] 。

3GW 是調(diào)節(jié)RNA 沉默的活性的通用工具

細(xì)胞內(nèi)包含GW/WG 重復(fù)單元的蛋白都在TGS 或PTGS 有積極的作用。GW/WG 重復(fù)單元與AGOs 相互作用，促進(jìn)了RISC的形成。病毒P38蛋白是基因沉默抑制因子，那么由GW 調(diào)節(jié)的P38 和AGO1 結(jié)合后又是怎樣抑制基因沉默的？因?yàn)镻38 似乎沒有影響AGO1 蛋白的穩(wěn)定性，所以P38 和AGO1 結(jié)合干擾了viRNAs 、siRNAs 與 AGO1 的結(jié)合，并進(jìn)一步可能阻止AGO1 與具有功能的RISC 結(jié)合[2]（圖1 [23]）。

因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)包含GW/WG 的蛋白質(zhì)包含RNA識別因子(如GW182) 或新的RNA結(jié)合序列(如KTF1) ，所以細(xì)胞內(nèi)包含GW/WG 的蛋白質(zhì)似乎與RNA 結(jié)合活性息息相關(guān)[22] 。RNA 結(jié)合活性很可能幫助AGO 結(jié)合siRNAs 以更有效的尋找和發(fā)現(xiàn)用于基因沉默的RNA。作為外殼蛋白，P38 也有RNA 結(jié)合活性，P38 可能與目標(biāo)RNAs 相互作用并協(xié)助產(chǎn)生RISC，因此與細(xì)胞內(nèi)GW/WG 蛋白結(jié)合RNA 存在競爭。盡管對于多細(xì)胞動物GW182 的同源蛋白在植物中沒有報(bào)道，但是在植物中AGO1 可能需要和包含GW/WG 的蛋白相結(jié)合以形成具有功能的RISC。病毒P38 和細(xì)胞內(nèi)包含GW/WG 的蛋白與AGO1 存在競爭性結(jié)合，并決定了以RNA 基因沉默為基礎(chǔ)的寄主防御和病毒反防御之間的競爭。

GW/WG 蛋白能和AGOs 結(jié)合，它所調(diào)節(jié)的抑制基因沉默的方式可能被病原體和寄生蟲用于對抗寄主RNAi 防御。事實(shí)上，另一個含GW 模型的病毒基因沉默抑制因子，甘薯斑點(diǎn)病毒(SPMMV， Potyviridae) 的P1 蛋白能與AGO1 相互作用，并抑制siRNA編碼的RISC (Josef Burgyan， pers. Comm)。在Azevedo 等[2] 的研究中討論了一些細(xì)菌性病原體單細(xì)胞[24] 的毒性因子包含GW 重復(fù)單元，其GW重復(fù)單元有可能與AGOs 相互作用并干涉哺乳動物的RNA 沉默。與此同時(shí)，傳染性的阮病毒蛋白包含5個GW/WG 重復(fù)單元。阮病毒蛋白能結(jié)合RNAs[25]，其轉(zhuǎn)化需要RNAs 的刺激[26]。因此，阮病毒的GW/WG 與AGOs 有間接相互作用，并且阮病毒蛋白與RNAs 可以結(jié)合，它們兩者都有可能在阮病毒的轉(zhuǎn)化和發(fā)病機(jī)理中起重要作用。Azevedo 等[2] 的研究說明了一個包含GW 重復(fù)單元的蛋白在寄主中抑制基因沉默的模型。其中最吸引人的推論是：細(xì)胞內(nèi)一些包含GW 重復(fù)單元做為AGO 鉤的蛋白可能還沒有進(jìn)化到成為RISC的一部分，但是它可以直接或間接調(diào)節(jié)RNA 沉默路徑的活性。

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收稿日期：2011-09-22;修訂日期：2011-12-23

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（30870109）

作者簡介：申永梅(1987-)，女，山東菏澤人，在讀研究生，主要從事植物病毒分子方面研究。

通訊作者簡介：曹雪松(1962-)，男，安徽六安人，教授，主要從事植物病毒分子方面研究。