張文宣，趙 南，張金兒，朱江萍，劉義雄

(江西新瑞豐生化有限公司，江西 新干 331307)

赤霉素(俗稱920)屬于植物五大激素之一，是一種高效植物生長調(diào)節(jié)劑，能迅速地刺激植物的生長發(fā)育，促進(jìn)植物提早開花結(jié)實(shí)，有效地打破植物種子、塊莖的休眠期，促進(jìn)萌發(fā)，誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)，減少棉花花蕾脫落等，在農(nóng)、林、園藝等方面具有廣泛的用途。隨著赤霉素在啤酒生產(chǎn)、蔬菜水果、農(nóng)林畜牧等應(yīng)用領(lǐng)域的進(jìn)一步拓展，其市場前景將更廣闊。

赤霉素在我國已有近40年的生產(chǎn)歷史，早期有較多生產(chǎn)水平低的專利和基礎(chǔ)研究文獻(xiàn)報道[1]，偶見一些綜述性文獻(xiàn)[2]，實(shí)際應(yīng)用研究報道卻很少，20世紀(jì)70年代成功地篩選到4303高產(chǎn)菌株[3]，促進(jìn)了赤霉素生產(chǎn)的發(fā)展。隨著微生物細(xì)胞工程的研究與發(fā)展，原生質(zhì)體的形成、再生、融合與定向篩選技術(shù)越來越多地應(yīng)用在微生物的育種過程中。李武軍等[4]建立了藤倉赤霉菌原生質(zhì)體形成與再生技術(shù)；劉冬華等[5]進(jìn)行了原生質(zhì)體的紫外線誘變育種研究。

作者在借鑒上述研究的基礎(chǔ)上，對赤霉素原生質(zhì)體的制備純化工藝進(jìn)行改進(jìn)，并利用定向篩選機(jī)理，建立了赤霉素產(chǎn)生菌的誘變篩選模型，應(yīng)用于抗藥性突變高產(chǎn)菌株的篩選工作，取得了良好效果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株、試劑和培養(yǎng)基

出發(fā)菌株：藤倉赤霉菌4303-N菌株。

高滲溶液：0.7 mol·L-1NaCl溶液。

纖維素酶、蝸牛酶、果膠酶均為上海產(chǎn)，其余試劑均為CP或AR級。

斜面培養(yǎng)基(MM)：葡萄糖、硝酸鉀、瓊脂等。

菌絲生長培養(yǎng)基(MGM)：葡萄糖、甘氨酸、瓊脂等。

再生培養(yǎng)基(RM)：蔗糖、酵母膏等。

抗性再生培養(yǎng)基(RRM)：在 RM培養(yǎng)基中添加抗性物質(zhì)。

種子培養(yǎng)基(SM)：葡萄糖、糊精等。

發(fā)酵培養(yǎng)基(FM)：玉米淀粉、花生粉、黃豆粉等。

1.2 方法

1.2.1 幼嫩菌絲體的制備

從新鮮斜面上挑取少量菌絲體，放入含有石英砂、玻璃珠、生理鹽水的無菌三角瓶中，搖床振蕩10～20 min，得到菌絲斷片懸浮液，用1 mL無菌吸管吸取菌絲斷片懸浮液點(diǎn)種在平鋪于MGM平板上的濾膜紙表面，每個平板點(diǎn)種1 mL(約50～80滴)，28 ℃培養(yǎng)1～2 d可見薄層白色菌絲時，即為幼嫩菌絲體。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備

將長有幼嫩菌絲體的濾膜紙輕輕揭下，在混合酶液中將幼嫩菌絲體漂洗下來，于28 ℃進(jìn)行酶解，在酶解過程中，間歇搖動使酶解充分,定時取樣，在生物顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的形成并計數(shù)。菌絲及原生質(zhì)體混合物經(jīng)1500 r·min-1離心10 min，沉淀除去殘留酶液,再用高滲溶液洗滌2次，用G2漏斗或脫脂棉過濾除去大部分菌絲斷片，即得原生質(zhì)體懸浮液。

1.2.3 原生質(zhì)體的誘變

UV誘變：取原生質(zhì)體懸浮液約5 mL加入無菌平皿內(nèi),置于已預(yù)熱30 min的UV燈(15 W，波長253.7 nm)直下30 cm處，開蓋振蕩照射100 s左右。

NTG誘變：取原生質(zhì)體懸浮液分別用25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、75 μg·mL-1、100 μg·mL-1NTG處理30 min，以大量稀釋法終止反應(yīng)。上述處理均在避光條件下進(jìn)行。

取誘變處理后的原生質(zhì)體懸浮液分別涂布在含致死濃度的抗生素再生平板和不含抗生素再生平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)7～12 d，使抗藥性突變菌株得到再生，分別統(tǒng)計其再生菌落數(shù)，計算致死率和突變率。

×100%

×100%

正變率為：發(fā)酵單位≥110%的正變株占總篩選菌株的百分率。

1.2.4 原生質(zhì)體的定向再生

取誘變處理后的原生質(zhì)體懸浮液，用高滲溶液適當(dāng)稀釋后，分別涂布于RM平板(測定存活率)和RRM平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)6～8 d，使抗藥性突變菌株得到再生。同時取兩份未經(jīng)誘變處理的原生質(zhì)體懸浮液，一份用高滲溶液稀釋后，涂布于RM平板上作存活率對照測定；另一份用無菌水稀釋以休克原生質(zhì)體，涂布于RM平板上作再生率對照測定。

×100%

經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定,原生質(zhì)體在RM再生培養(yǎng)基上的再生率為16%左右，待抗性再生培養(yǎng)平板上長出抗藥性單菌落后，分別接種于MM斜面試管上，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d，置于4 ℃冰箱中待篩選。

1.2.5 抗藥性突變高產(chǎn)菌株的搖瓶篩選

將抗藥性菌株進(jìn)行搖瓶初篩和復(fù)篩。初篩為一級發(fā)酵,即從斜面上挖塊直接種入發(fā)酵搖瓶中。復(fù)篩為二級發(fā)酵，即將斜面上菌種挖塊種于種子搖瓶中于旋轉(zhuǎn)式搖床上28 ℃培養(yǎng)30～50 h，種子液長濃后，以8%～10%移種到發(fā)酵搖瓶中。初篩和復(fù)篩的發(fā)酵搖瓶均于28 ℃搖床培養(yǎng)8 d后，放瓶檢測發(fā)酵濾液的效價。

1.2.6 效價測定

參照文獻(xiàn)[3]。

1.2.7 配方優(yōu)化

將種子或發(fā)酵原有配方中的碳源、氮源、無機(jī)鹽等各設(shè)計2～4個濃度梯度，通過正交設(shè)計及結(jié)果分析，確定各成分的具體配比。

2 結(jié)果與討論

2.1 赤霉菌原生質(zhì)體制備工藝的改進(jìn)

針對赤霉菌絲為不產(chǎn)孢子的多核菌絲的特性，用復(fù)合破壁酶液(纖維素酶2%+蝸牛酶1%+果膠酶0.4%)對其進(jìn)行處理，使菌絲細(xì)胞壁酶解破壁釋放出游離的單核體(原生質(zhì)體)，然后再進(jìn)行誘變育種。通過混合酶液組分配比的優(yōu)化調(diào)整，進(jìn)一步完善了原生質(zhì)體的制備純化工藝。實(shí)驗(yàn)表明：采用微孔濾膜作載體、含甘氨酸的菌絲生長培養(yǎng)基、以幼嫩菌絲體為對象、經(jīng)復(fù)合破壁酶液酶解等新工藝，能使原生質(zhì)體的釋放量提高一個數(shù)量級，并且其再生活性明顯得以增強(qiáng)。正是由于原生質(zhì)體制備工藝的完善與成熟，從而確保了基因突變后的遺傳個體絕大部分都是純合體，避免了高產(chǎn)性狀經(jīng)傳代后水平回復(fù)的現(xiàn)象。

2.2 理化誘變劑誘變劑量的選擇

2.2.1 物理誘變劑UV照射劑量的選擇(表1)

表1 UV照射時間對赤霉素原生質(zhì)體致死率的影響

從表1可以看出，隨著UV照射時間的延長，原生質(zhì)體的致死率增大。選擇存活率在10%～20%左右，即UV照射時間90～120 s左右為原生質(zhì)體的UV照射劑量。

2.2.2 化學(xué)誘變劑NTG誘變劑量的選擇[6](表2)

表2 NTG誘變劑量對赤霉菌原生質(zhì)體的致死率及誘變效果的影響

從表2可以看出，隨著NTG誘變劑量的增加，其原生質(zhì)體的致死率增大，正變率相應(yīng)降低。選擇正變率大、致死率超過50%的NTG誘變劑量，即25 μg·mL-1處理30 min左右為其作用劑量。

2.3 赤霉素原生質(zhì)體抗藥性致死突變標(biāo)志誘變篩選模型的建立

單核的原生質(zhì)體經(jīng)過理化因子(如UV、NTG等)誘變處理后，絕大部分仍保持原有的遺傳穩(wěn)定性或被誘變劑直接殺死，能發(fā)生基因突變的幾率相當(dāng)小，而變異又大多產(chǎn)生負(fù)變，所需要的正突變個體就更少,如果采用傳統(tǒng)的隨機(jī)篩選法來篩選高產(chǎn)菌株，難以取得成功。在此采用定向篩選技術(shù)來濃縮突變型、陶汰野生型,使正變菌株得到定向再生，而負(fù)變菌株不能再生，從而大大地節(jié)省人力物力，極大地提高篩選效率。

2.3.1 定向篩選機(jī)理

抗生素產(chǎn)生菌在發(fā)酵過程中，當(dāng)抗生素積累超過一定濃度時會導(dǎo)致產(chǎn)生菌的自殺，產(chǎn)生菌通過反饋抑制和反饋?zhàn)瓒魜硐拗瓶股氐倪^量積累，進(jìn)行代謝的自我調(diào)節(jié)，從而保護(hù)菌株本身[7]，由此可將赤霉菌自身產(chǎn)生的赤霉素作為抗性篩選物質(zhì)；另外，在抗生素產(chǎn)生菌的遺傳物質(zhì)中，抗性基因與抗生素合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因緊密連鎖，因而各基因之間易發(fā)生共突變[8]，由此也可選擇其它對赤霉素菌體有抑制殺菌作用的敏感抗生素(如氯霉素)作為抗性篩選物質(zhì)[6]。產(chǎn)生菌經(jīng)誘變后如能在較高濃度的赤霉素、氯霉素等抗性篩選物質(zhì)存在的環(huán)境中生存，就能解除抗生素的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簦@樣的菌株將能合成更多的抗生素。

2.3.2 抗性篩選物質(zhì)赤霉素、氯霉素亞致死濃度的選擇

將赤霉素、氯霉素分別制成0～4000 μg·mL-1的濃度梯度板，將制備好的原生質(zhì)體懸浮液按每皿0.1 mL均勻涂布在該濃度梯度板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)4～5 d，根據(jù)再生平板上菌落生長情況，推算出赤霉素、氯霉素的大致亞致死濃度分別是3000 μg·mL-1左右和2000 μg·mL-1左右，再以此濃度為中心濃度，以100 μg·mL-1為一檔次，分別向上遞增和向下遞減制成系列濃度平板，精確測定出赤霉素亞致死濃度為2800 μg·mL-1、氯霉素亞致死濃度為2000 μg·mL-1。

2.3.3 誘變篩選模型的建立

依據(jù)定向篩選機(jī)理，以亞致死濃度作為抗性篩選物質(zhì)的加入濃度，將2800 μg·mL-1的赤霉素或2000 μg·mL-1的氯霉素準(zhǔn)確加入到赤霉素原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基(RM)中，成為抗性再生培養(yǎng)基(RRM)，建立赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體抗藥性致死突變標(biāo)志的誘變篩選模型，通過RRM抗性再生培養(yǎng)基，進(jìn)行定向篩選，真正達(dá)到了濃縮突變型、陶汰野生型的效果。

2.3.4 誘變篩選模型的應(yīng)用

依據(jù)所建立的赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體抗(耐)藥性致死突變標(biāo)志的誘變篩選模型，進(jìn)行赤霉素菌種的誘變改良，獲得了N7298等多株高產(chǎn)誘變菌株，并推廣應(yīng)用于赤霉素的工業(yè)化生產(chǎn)。選育系譜如下：

2.4 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

高產(chǎn)誘變菌株與出發(fā)菌株相比，遺傳基因發(fā)生了較大變化，生理、生化等遺傳特征表現(xiàn)出一定差異，原有的發(fā)酵工藝已不能適應(yīng)其生長需要，影響了其高產(chǎn)性能的充分表達(dá)。采用正交實(shí)驗(yàn)法、方差分析法、濃度梯度法、回歸分析法等優(yōu)化發(fā)酵配方和完善發(fā)酵工藝。通過多次配方優(yōu)化，得到N7298的優(yōu)化配方為：發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源一3%，碳源二9%，氮源一1.2%，氮源二0.6%，無機(jī)鹽一0.1%，無機(jī)鹽二0%，無機(jī)鹽三0.1%。無機(jī)鹽二不宜加入，其它成分不變。以優(yōu)化配方與原配方對N7298進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

2.5 高產(chǎn)誘變菌株N7298的搖瓶小試與大罐試產(chǎn)結(jié)果

表3 優(yōu)化配方與原配方搖瓶小試對比結(jié)果/%

表4 N7298與出發(fā)菌株N的效果對比/%

由表4可知，N7298菌株無論是搖瓶小試還是大罐(20 m3)試產(chǎn)的產(chǎn)量都較出發(fā)菌株N提高24%左右。如果以年產(chǎn)赤霉素80 t計，則年新增產(chǎn)量19.2 t，年新增利稅960萬元 (以每千克新增產(chǎn)品降低發(fā)酵成本500元計算)，經(jīng)濟(jì)效益非常顯著。

3 結(jié)論

應(yīng)用所建立的赤霉素誘變篩選模型，進(jìn)行產(chǎn)生菌原生質(zhì)體理化誘變-定向篩選，成功得到N7298等多株原生質(zhì)體再生的抗藥性突變高產(chǎn)菌株。N7298的搖瓶效價比出發(fā)菌株N提高23.4%、20 m3罐生產(chǎn)水平提高24.1%。

N7298高產(chǎn)誘變菌株的成功選育，為今后進(jìn)一步應(yīng)用誘變篩選模型、開展赤霉素選育的定向篩選工作積累了經(jīng)驗(yàn)，且對其它抗生素產(chǎn)生菌的誘變篩選工作具有較廣泛的借鑒意義。

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