倪孟祥，馬麗娜

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物制藥教研室，江蘇 南京 210009)

糖尿病是嚴(yán)重威脅著人類健康的重大疾病之一，可分為Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病，其中Ⅱ型糖尿病占90％以上[1]。目前針對Ⅱ型糖尿病的口服降糖藥主要有以下四類：磺酰脲類、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑類及噻唑烷二酮類，其中α-葡萄糖苷酶抑制劑作為一類有效的口服降糖藥受到廣泛關(guān)注。

α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制人體小腸上皮絨毛膜刷狀緣上α-葡萄糖苷酶的活性，減少食物中碳水化合物的消化，延緩葡萄糖的生成和吸收，從而達到降低餐后高血糖、減少其并發(fā)癥發(fā)生的目的[2]。目前臨床上使用的α-葡萄糖苷酶抑制劑(如阿卡波糖、伏格列波糖等)均采用化學(xué)與生物相結(jié)合的方法制備,價格昂貴且存在不良反應(yīng),因此微生物來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為研究熱點[3]。

作者在此建立了α-葡萄糖苷酶抑制劑的體外篩選模型,并且從5株海洋極地放線菌和5株海洋極地細菌中篩選出6株具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株，其中菌株N-1的抑制活性較強，并對菌株N-1進行了進一步研究。

1 實驗

1.1 菌株及試劑

海洋極地放線菌5株(N-1、BM-22、BM-11、F-1-2、FM-5)及海洋極地細菌5株(T-2-2-1、T-1-3-Y2、T-1-1-2、T0-2-5、T0-2-1)，自行保存。其中菌株N-1初步鑒定為生金鏈霉菌[4]。

α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase，EC 3.2.1.20)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)；阿卡波糖，Bayer；其它試劑均為分析純。

α-葡萄糖苷酶液：將α-葡萄糖苷酶凍干粉用pH值6.8的0.1 mol·L-1含0.2％ BSA的磷酸鹽緩沖溶液配制成溶液，分裝，-20 ℃保存。

底物：將PNPG用pH值6.8的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液配制成10 mmol·L-1的工作液，分裝，-20 ℃保存。

阿卡波糖溶液：將一片阿卡波糖(含阿卡波糖50 mg)溶解于pH值6.8的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液中，用容量瓶定容至50 mL，超聲溶解，用0.22 μm濾膜過濾，室溫保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面菌種培養(yǎng)基(g)：可溶性淀粉20，NaCl 0.5，KNO31，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO40.01，海鹽20，瓊脂20，自來水1000 mL，pH值6.8～7.2。

種子培養(yǎng)基(g)：酵母提取物0.25，葡萄糖0.5，可溶性淀粉2，蛋白胨2.5，海鹽2，CaCO30.1，自來水100 mL，pH值6.8～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基:60 g黃豆沸水煮2 h，取上清,添加酵母提取物2.5 g、可溶性淀粉20 g、海鹽20 g、CaCO31 g,用自來水補足1000 mL,pH值6.8。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)及搖瓶發(fā)酵

將純化菌株接種于斜面菌種培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，直至灰白色的孢子形成；瓊脂挖塊于無菌試管中，用無菌生理鹽水吹打均勻，形成孢子懸液。將孢子懸液以1％接種量接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，于28 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)72 h作為種子液。將種子液以5％的接種量接種于裝有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1000 mL錐形瓶中，于28 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液用低溫高速離心機10 000 r·min-1離心20 min，取上清用布氏漏斗抽濾，得到澄清發(fā)酵液，4 ℃冰箱保存。

1.3.2 樣品液的制備

將2 L新鮮的發(fā)酵液用8層紗布過濾除去菌體,于4500 r·min-1、4 ℃離心20 min,上層發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾，得到澄清發(fā)酵液。以預(yù)處理的大孔樹脂XAD-7HP吸附,先用蒸餾水洗滌至無氯離子等無機鹽離子,再依次用6～8倍柱體積的20％、40％、60％、80％的甲醇溶液進行梯度洗脫,收集洗脫液,測定不同洗脫組分的活性,并減壓濃縮成干粉，得到除去無機鹽、部分色素的粗提物粉末，將粗提物粉末用DMSO配制成0.1 mg·mL-1的溶液，即得樣品液。

1.3.3α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選模型的建立及應(yīng)用

1.3.3.1α-葡萄糖苷酶抑制劑活性測定[5]

以PNPG為底物、0.2 mol·L-1Na2CO3為終止液,405 nm比色測定。

酶活力單位定義為:在37 ℃、pH值6.8的條件下,1 min內(nèi)水解PNPG釋放1 mol對硝基苯酚(PNP)所需的酶量。

抑制劑活力單位定義為:在相同的條件下降低1個酶活力單位所需的抑制劑量。

1.3.3.2 篩選模型的建立

采用PNPG法[6](略有改動)。PNPG法的原理是：由于α-葡萄糖苷酶催化水解PNPG釋放出的PNP在405 nm處有一定的吸光度，因此，可通過檢測PNP的量來測定α-葡萄糖苷酶活性的變化，從而篩選出對α-葡萄糖苷酶有抑制作用的活性物質(zhì)。

取α-葡萄糖苷酶液40 μL，加入樣品液200 μL(pH值6.8)、pH值6.8的磷酸鹽緩沖溶液600 μL，37 ℃水浴保溫10 min；然后加入50 μL PNPG溶液，37 ℃水浴反應(yīng)20 min；再加入800 μL 0.2 mol·L-1的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在405 nm處測定吸光度(An)。以磷酸鹽緩沖溶液代替酶液作為陰性對照；以磷酸鹽緩沖溶液代替樣品液作為空白對照；以200 μL 1 mg·mL-1的阿卡波糖溶液代替樣品液作為陽性對照。按下式計算樣品液對α-葡萄糖苷酶的抑制率(I)：

式中:An為加入樣品液反應(yīng)后的吸光度；A0為未加樣品液反應(yīng)后的吸光度；A背景為只加樣品液的吸光度。

為檢驗是否存在假陽性：在同等濃度的PNPG中加入樣品液保溫20 min，測試405 nm處吸光度的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加樣前后吸光度無明顯變化，表明樣品液中不存在與PNPG反應(yīng)的物質(zhì)。

1.3.3.3 篩選模型的有效性驗證

以阿卡波糖為陽性對照，檢驗篩選模型的有效性。具體過程為：通過對底物濃度、酶濃度、反應(yīng)時間的研究最終建立較為規(guī)范的篩選模型；在該篩選模型下，通過測定不同濃度(0.2 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1)的阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制效果(重復(fù)3次，每組3個平行，取平均值)，以阿卡波糖濃度為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)，繪制抑制活性曲線，以檢驗篩選模型的有效性。

1.3.3.4 菌株N-1篩選模型的應(yīng)用

以5株海洋極地細菌和5株海洋極地放線菌為篩選對象，利用建立的篩選模型進行篩選，依據(jù)篩選結(jié)果選取對α-葡萄糖苷酶的抑制作用最強的菌株進行后續(xù)實驗。

1.3.4 菌株N-1的抑制動力學(xué)實驗

1.3.4.1 保溫時間對抑制活性的影響

在5支試管中分別加入40 μLα-葡萄糖苷酶和200 μL N-1樣品液，在37 ℃水浴中分別保溫5 min、10 min、15 min、20 min、30 min，然后加入50 μL PNPG，反應(yīng)20 min后測定其對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.3.4.2 溫度對抑制活性的影響

將N-1樣品液分別置于30～100 ℃的水浴中，60 min后冷卻至室溫，測定其對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.3.4.3 樣品液濃度對抑制活性的影響

將N-1樣品液濃度(mg·mL-1)分別稀釋到0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01，測定其對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.3.4.4 pH值對抑制活性的影響

取14支試管分別用HCl或NaOH調(diào)N-1樣品液的pH值為1～14(梯度為1)，置沸水浴中60 min，冷卻至室溫，調(diào)pH值為7，測定其對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.3.4.5 N-1樣品液與阿卡波糖的抑制活性比較實驗

將N-1樣品液與1 mg·mL-1阿卡波糖分別稀釋至原濃度的0.1倍、0.2倍、0.4倍、0.6倍、0.8倍，測定其對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.3.5 活性物質(zhì)的極性及成分分析

取N-1發(fā)酵液10 mL,調(diào)pH值為7，分別用等體積的乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷萃取,充分振蕩、靜置分層,將有機溶劑蒸干后，用DMSO溶解，測各樣品的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用乙酸乙酯萃取的樣品活性最大，達到原發(fā)酵液的80％。因此，以乙酸乙酯萃取產(chǎn)物為樣本進行以下成分鑒定實驗。

蛋白質(zhì)檢測:取樣品液1 mL于試管中,加入適量雙縮脲試劑,搖勻，加熱至沸騰,冷卻后觀察顏色變化。如果顯紫紅色，表明可能存在蛋白質(zhì)和肽類。

氨基酸檢測:取樣品液1 mL于試管中,滴加數(shù)滴0.2％茚三酮溶液,加熱至沸騰,冷卻后觀察顏色變化。如果顯藍紫色，表明含有氨基酸。

糖類檢測(Molish試驗):取樣品液1 mL于試管中,加入α-萘酚試劑數(shù)滴,再沿試管壁滴加少量濃硫酸。如果樣品液于濃硫酸接觸面產(chǎn)生紫紅色環(huán), 表明可能存在糖類、苷類或其它還原性物質(zhì)。

皂苷檢測:取樣品乙醇提取液蒸去乙醇后的殘渣溶于0.5 mL醋酐中,滴加1滴濃硫酸。如果顯紫紅色且溶液上層逐漸變綠,表明含有甾體三萜類和皂苷物質(zhì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩選模型的有效性驗證結(jié)果

通過建立的篩選模型，測定了不同濃度的阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率，結(jié)果見圖1。

圖1 阿卡波糖的抑制活性曲線

由圖1可看出，該模型能靈敏地監(jiān)測到0.2 mg·mL-1以上濃度的阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，說明該篩選模型有較高的可行性。

2.2 海洋微生物發(fā)酵液中α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選結(jié)果(表1)

表1 10株海洋微生物發(fā)酵液中α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選結(jié)果

由表1可知，共有6株菌株的代謝產(chǎn)物有不同程度的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中菌株N-1的代謝產(chǎn)物的抑制活性最強，因此選取其進行后續(xù)研究。

2.3 保溫時間對抑制率的影響(圖2)

圖2 保溫時間對抑制率的影響

由圖2可知，樣品液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用非常迅速，當(dāng)保溫時間為5 min時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率達到74％；繼續(xù)延長保溫時間，抑制率基本保持在70％以上。表明樣品液對α-葡萄糖苷酶有很高的親和性，是一種活性很強的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

2.4 溫度對抑制率的影響(圖3)

圖3 溫度對抑制率的影響

由圖3可知，溫度對抑制率有一定的影響。當(dāng)溫度超過40 ℃后，樣品液對α-葡萄糖苷酶的抑制率開始下降；當(dāng)溫度為50 ℃時，抑制率下降10％；繼續(xù)升高溫度，抑制率變化不大。表明50～100 ℃時，樣品液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性較穩(wěn)定。

2.5 樣品液濃度對抑制率的影響(圖4)

圖4 樣品液濃度對抑制率的影響

由圖4可知，隨著樣品液濃度的增大，其對α-葡萄糖苷酶的抑制率不斷上升；當(dāng)濃度達到0.10 mg·mL-1時，抑制率為95.79％。表明樣品液對α-葡萄糖苷酶有很強的抑制活性。

2.6 pH值對抑制率的影響(圖5)

圖5 pH值對抑制率的影響

由圖5可知，樣品液對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨pH值的增大緩慢下降。說明樣品液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果穩(wěn)定，在pH值為1～14范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 N-1樣品液與阿卡波糖的抑制活性比較

將N-1樣品液與1 mg·mL-1阿卡波糖分別稀釋后，測定其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以抑制率為50％左右為合適的稀釋倍數(shù)，結(jié)果見圖6。

圖6 N-1樣品液與阿卡波糖的抑制活性比較

由圖6可知，稀釋0.2倍的N-1樣品液對α-葡萄糖苷酶的抑制率為43.77％，1 mg·mL-1的阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率約為45.07％，那么，可計算出：每毫升N-1樣品液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性約相當(dāng)于5 mg[(1/0.2)×1 mg·mL-1]的阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

2.8 活性物質(zhì)的極性及成分分析

有機溶劑萃取結(jié)果表明，乙酸乙酯的萃取效果最好，萃取率達到80％。萃取物經(jīng)雙縮脲試驗、茚三酮試驗、檢測糖類和皂苷類的試驗結(jié)果均為陰性，表明活性物質(zhì)并非蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、甾體三萜類及皂苷類，具體成分還有待進一步分析。

3 結(jié)論

建立了α-葡萄糖苷酶抑制劑的體外篩選模型。以其對10株海洋微生物進行篩選，發(fā)現(xiàn)有6株菌株的代謝產(chǎn)物均具有不同程度的α-葡萄糖苷酶抑制作用，其中菌株N-1的代謝產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用最強,每毫升N-1樣品液的活性代謝產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用相當(dāng)于5 mg阿卡波糖的抑制作用；該活性產(chǎn)物具有較強的酸堿耐受性及溫度耐受性，在pH值1～14、50～100 ℃時穩(wěn)定性較好；初步分析活性產(chǎn)物的成分并非蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類及皂苷類物質(zhì)。

參考文獻：

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