高照明，曹現(xiàn)平，張迎迎，張玉冰

(青島科技大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，山東 青島 266042)

2008年初，美國(guó)及歐洲等12個(gè)國(guó)家發(fā)生了嚴(yán)重的肝素鈉注射液不良反應(yīng)事件[1]，數(shù)百例病人出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，表面皮膚水腫，心跳過(guò)快，血壓過(guò)低，惡心嘔吐[2]，約百例病人死亡[3]。自美國(guó)FDA應(yīng)用1HNMR和CE查出此批肝素鈉(Heparin sodium，HP)原料中存在類(lèi)肝素鈉雜質(zhì)——多硫酸軟骨素(Oversulfated chondroitin sulfate，OSCS)[2]，可能為引起病人不良過(guò)敏反應(yīng)的異常雜質(zhì)[4]之后，在數(shù)批肝素鈉及低分子肝素鈉中均發(fā)現(xiàn)了OSCS[5]。究竟OSCS是否為致命的罪魁禍?zhǔn)祝鲊?guó)專(zhuān)家從分子結(jié)構(gòu)、藥理、臨床、來(lái)源等方面對(duì)其進(jìn)行了論證[2～6]。Kishimoto等[7]證實(shí)OSCS是引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的污染物，其在血漿中激活激肽釋放酶產(chǎn)生緩激肽，誘發(fā)了過(guò)敏毒素的產(chǎn)生。Zhang等[3]證實(shí)雜質(zhì)硫酸皮膚素(Dermatan sulfate，DS)、硫酸軟骨素(Chondroitin sulfates，CS)無(wú)毒，而OSCS有毒，可能是導(dǎo)致百例病人死亡的原因。

關(guān)于OSCS的來(lái)源引起了各國(guó)科學(xué)家的紛爭(zhēng)：Guerrini等[2]認(rèn)為OSCS不是天然存在的，而是人工合成的;Pan等[8]指出肝素鈉事件中，OSCS并不是未分級(jí)肝素鈉中唯一的污染物，與人工合成OSCS相比，OSCS更可能來(lái)源于多硫酸化的糖胺聚糖廢料;Keire等[9]認(rèn)為OSCS是人工半合成的，是人為添加到肝素鈉中的。

作者在此從肝素鈉的來(lái)源——豬小腸著手，將豬小腸分離為腸粘膜、漿膜、腸衣三部分并分別酶解提取其中的粘多糖，進(jìn)而對(duì)粘多糖成分進(jìn)行分析，以期對(duì)OSCS的來(lái)源進(jìn)行深入研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮豬小腸購(gòu)于青島李滄西流莊市場(chǎng)。

胰蛋白酶、D-254樹(shù)脂，青島九龍生物醫(yī)藥有限公司；重水(D2O)，氘代度99.8％，CIL公司；三甲基硅丙磺酸鈉(TSP)，氘代度98％，Sigma公司；NaCl、HCl、乙醇，分析純，青島正業(yè)化學(xué)試劑廠(chǎng)。

Bruker AV500型核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司。

1.2 腸粘膜、漿膜、腸衣中粘多糖的提取

將新鮮豬小腸洗凈，用竹刀輕刮出腸粘膜并收集；再將豬小腸最外層的漿膜剝離并收集；剩余部分即為腸衣。

將腸粘膜/漿膜/腸衣投入反應(yīng)鍋，按其質(zhì)量的5％加入胰蛋白酶，用3 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)pH值為8～9，同時(shí)攪拌升溫至40 ℃左右，維持2.5 h；再升溫至60 ℃，按腸粘膜/漿膜/腸衣質(zhì)量的2％加入NaCl，升溫至90 ℃，調(diào)pH值為6～7，加熱至沸騰，保持10 min，趁熱用200目尼龍篩過(guò)濾；待濾液冷卻至60 ℃左右，用3 mol·L-1的 NaOH溶液調(diào)pH值為8～9，按濾液量的5％加入D-254樹(shù)脂，攪拌吸附6 h，靜置1 h(吸附過(guò)程保持pH值為8～9)，過(guò)200目尼龍篩；在樹(shù)脂中加入等體積自來(lái)水漂洗數(shù)次，用pH值為10的3 mol·L-1NaCl溶液攪拌洗脫樹(shù)脂2 h(NaCl溶液用量與樹(shù)脂量相等)；過(guò)200目尼龍篩，收集濾液；重復(fù)洗脫2次，合并濾液；在濾液中加入等體積乙醇，攪拌10 min，靜置12 h以上；收集下層沉淀物，用乙醇脫水3次；將沉淀物置60 ℃烘箱中烘干，得粘多糖。

1.3 分析檢測(cè)

采用1HNMR對(duì)提取的粘多糖進(jìn)行定性、定量分析。

1H的共振頻率為500.03 MHz；脈沖序列(PULPROG)為zgcppr；采樣次數(shù)(NS)為100次；譜寬(SWH)為9615.385 Hz；采樣時(shí)間(AQ)為3.407940 s；溫度(TE)為298 K；馳豫時(shí)間(D1)為10.00 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 HP、CS、DS、OSCS的1HNMR特征峰歸屬

CS、DS、OSCS作為HP的類(lèi)似物質(zhì)與HP在結(jié)構(gòu)等方面十分相似，故測(cè)定HP中的CS、DS、OSCS有一定難度，本實(shí)驗(yàn)從每種物質(zhì)的USP鑒別標(biāo)準(zhǔn)品的1HNMR研究入手，找出能代表每種物質(zhì)的特征峰，使得分析HP中的類(lèi)似物質(zhì)變得簡(jiǎn)單可行。HP、CS、DS、OSCS的1HNMR圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 HP、CS、DS、OSCS的1HNMR圖譜

由圖1可以看出：每種單一物質(zhì)的糖環(huán)區(qū)域質(zhì)子化學(xué)位移均集中在3.0～6.0 ppm之間，且重疊、復(fù)雜，無(wú)從分析，但在化學(xué)位移2.0 ppm左右均有尖銳獨(dú)立的單峰，容易分析；HP、CS、DS、OSCS二糖單元中N-乙酰氨基中甲基的信號(hào)分別出現(xiàn)在化學(xué)位移(ppm)2.04、2.03(CS-A)、2.02(CS-C)、2.08、2.15處，雖然化學(xué)位移相近但并不相同。故確定這4種類(lèi)似物質(zhì)的1HNMR的特征峰分別為2.04 ppm、2.03 ppm(CS-A)、2.02 ppm(CS-C)、2.08 ppm、2.15 ppm，運(yùn)用各自特征峰分析HP中的雜質(zhì)變得簡(jiǎn)單可行。

為了驗(yàn)證在同一批肝素鈉樣品中各特征峰是否能分開(kāi)，將上述4種物質(zhì)按比例(HP∶CS∶DS∶OSCS=60∶10∶25∶5)混合，其1HNMR圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 肝素鈉混合品的1HNMR圖譜

由圖2可以看出，肝素鈉混合品中含有OSCS、DS、CS等雜質(zhì)，并能通過(guò)特征峰峰高方便地計(jì)算出各自含量[10，11]。

2.2 腸粘膜、漿膜、腸衣酶解產(chǎn)物的粘多糖成分的定性分析

6 kg的新鮮豬小腸經(jīng)分離后得到3.6 kg腸粘膜、0.9 kg漿膜、1.5 kg腸衣，再經(jīng)過(guò)酶解、鹽解、去蛋白核酸、樹(shù)脂吸附、洗脫、沉淀、烘干，得到褐黃色的2.58 g腸粘膜產(chǎn)品、0.66 g漿膜產(chǎn)品、1.08 g腸衣產(chǎn)品。用1HNMR分別對(duì)其進(jìn)行定性分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 腸粘膜(a)、漿膜(b)、腸衣(c)的1HNMR圖譜

由圖3a可以看出，腸粘膜粘多糖的主要成分為HP(δ2.04)，且含有DS(δ2.08)、CS-C(δ2.02)等雜質(zhì)，但δ2.15左右無(wú)特征峰出現(xiàn)，說(shuō)明不含OSCS雜質(zhì)。峰高(Peak height，PKH)大小依次為：PKHHP>PKHDS>PKHCS-C，說(shuō)明雜質(zhì)的相對(duì)含量DS>CS-C。

由圖3b可以看出，漿膜粘多糖的主要成分為HP(δ2.04)和DS(δ2.08)，且含有CS-C(δ2.02)雜質(zhì)，但δ2.15左右無(wú)特征峰出現(xiàn)，說(shuō)明不含OSCS雜質(zhì)。PKHDS≈PKHHP>PKHCS-C，說(shuō)明DS與HP含量相當(dāng)，含有少量雜質(zhì)CS-C。

由圖3c可以看出，腸衣的主要成分為DS(δ2.08)，且含有HP(δ2.04)，CS-A(δ2.03)、CS-C(δ2.02)等雜質(zhì)，但δ2.15左右無(wú)特征峰出現(xiàn)，說(shuō)明不含OSCS雜質(zhì)。PKHDS>PKHHP>PKHCS-A>PKHCS-C，說(shuō)明雜質(zhì)的相對(duì)含量HP>CS-A>CS-C。

2.3 腸粘膜、漿膜、腸衣酶解產(chǎn)物的粘多糖成分的定量分析

根據(jù)1HNMR圖譜(圖3)中的各特征峰峰高對(duì)各成分進(jìn)行定量分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 腸粘膜、漿膜、腸衣中粘多糖的定量分析

從表1可以看出：腸粘膜粘多糖中，HP占47.23％，DS占36.95％，CS-C占15.81％，不含CS-A和OSCS雜質(zhì)，產(chǎn)物總質(zhì)量為2.58 g，故HP、DS、CS-C的含量分別為1.22 g、0.95 g和0.41 g，其中含量最高的為HP，其它含量DS>CS-C；漿膜粘多糖中，HP占43.62％，DS占44.77％，CS-C占11.61％，不含CS-A和OSCS雜質(zhì)，產(chǎn)物總質(zhì)量為0.66 g，故HP、DS、CS-C的含量分別為0.29 g、0.30 g、0.08 g，其中DS和HP的含量相當(dāng)，CS-C含量相對(duì)較少；腸衣粘多糖中，HP占31.46％，DS占38.52％，CS-C占13.61％，CS-A占16.42％，不含OSCS雜質(zhì)，產(chǎn)物總質(zhì)量為1.08 g，故HP、DS、CS-C、CS-A的含量分別為0.34 g、0.42 g、0.15 g和0.18 g，其中含量最高的為DS，其它含量HP>CS-A>CS-C。

將腸粘膜、漿膜、腸衣的粘多糖峰高百分比與含量列表進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 腸粘膜、漿膜、腸衣中粘多糖組成比較

由表2可以看出：

(1)HP在腸粘膜中占47.23％，在漿膜中占43.62％，在腸衣中占31.46％。故，HP在各部分的百分含量大小依次為：腸粘膜>漿膜>腸衣；HP在各部分的含量大小依次為：腸粘膜(1.22 g)>腸衣(0.34 g)>漿膜(0.29 g)。

(2)DS在腸粘膜中占36.95％，在漿膜中占44.77％，在腸衣中占38.52％。故，DS在各部分的百分含量大小依次為：漿膜>腸衣>腸粘膜，其中DS在漿膜中的百分含量最高，在腸粘膜和腸衣中的百分含量相近；DS在各部分的含量大小依次為：腸粘膜(0.95 g)>腸衣(0.42 g)>漿膜(0.30 g)。

(3)CS-C在腸粘膜中占15.81％，在漿膜中占11.61％，在腸衣中占13.61％。故，CS-C在各部分的百分含量大小依次為：腸粘膜>腸衣>漿膜，但相差不是很大；CS-C在各部分的含量大小依次為：腸粘膜(0.41 g)>腸衣(0.15 g)>漿膜(0.08 g)。

(4)CS-A在腸衣中占16.42％，質(zhì)量為0.18 g，在腸粘膜、漿膜中均不含CS-A雜質(zhì)。

綜上，HP作為要分離的有效產(chǎn)物，在腸粘膜(1.22 g)、漿膜(0.29 g)、腸衣(0.34 g)中的含量比例為66.0∶15.6∶18.4，表明有效成分HP主要來(lái)源于腸粘膜；而有害物質(zhì)OSCS在這三部分中均未發(fā)現(xiàn)。

3 結(jié)論

采用酶解法提取豬小腸腸粘膜、漿膜、腸衣中的粘多糖，并通過(guò)1HNMR對(duì)提取的粘多糖成分進(jìn)行定性、定量分析。結(jié)果表明，腸粘膜的粘多糖主要成分為肝素鈉，并含有硫酸皮膚素和硫酸軟骨素C；漿膜中肝素鈉和硫酸皮膚素的含量相當(dāng)，并含有少量硫酸軟骨素C；腸衣的粘多糖主要成分為硫酸皮膚素，并含有肝素鈉、硫酸軟骨素A及硫酸軟骨素C；腸粘膜、漿膜、腸衣均不含多硫酸軟骨素。

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