王 秀，何裕民

(1.皖南醫(yī)學院 中西醫(yī)結(jié)合研究中心，安徽 蕪湖 241002;2.上海中醫(yī)藥大學 中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室，上海 201203)

人參性溫大補，是扶正補益的代表藥物，現(xiàn)代研究證實多種人參皂甙具有抗腫瘤作用［1，2］?，F(xiàn)代時間生物學研究表明，人體的生理功能、病理變化具有晝夜節(jié)律變化，同樣的藥物在不同時間應用后，療效也不相同。本課題以肝癌為模型，選取卯、酉二個時間點為用藥時間，從抗氧化、免疫等方面對人參皂甙擇時治療肝癌進行探討。

1 實驗材料與方法

1.1 動物與瘤株 昆明種小鼠90只，雄性，(14±2)g，由上海斯萊克實驗動物中心(合格證號:SCXK(滬)2003-0003)提供。小鼠H22肝癌腹水型細胞，購自上海麥莎生物科技有限公司，細胞復蘇后注入小鼠腹中，腹水傳代保存。

1.2 方法 將小鼠置于人工光照周期 LD12∶12(7∶00～19∶00時光照，19∶00～7∶00 時黑暗)，恒溫恒濕，清潔級條件下常規(guī)飼養(yǎng)。2周后，采用H22肝癌細胞懸浮液進行右前肢皮下接種造模，造模后繼續(xù)在人工光照環(huán)境下喂養(yǎng)。待瘤體長至0.5 cm左右，隨機分組，一組為正常組，一組為模型組，余組為擇時用藥組，每組10只小鼠。用藥組予以人參皂甙溶液灌胃［25 mg/(kg·d)］，正常組、模型組予以生理鹽水灌胃。用藥10 d后取血，離心取上清，－20℃保存待測。小鼠處死后，解剖取脾臟、胸腺稱重，并剝?nèi)∧[瘤，稱重后，取腫瘤組織－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 造模方法 抽取腹腔傳代小鼠腹水，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，收集細胞，用 PBS液清洗兩次后，取中上層細胞，以生理鹽水調(diào)整細胞密度為3×107/ml，于昆明種小鼠右側(cè)前肢腋下行無菌皮下接種，接種量為每只0.2 ml細胞懸液，每只小鼠接種的細胞總數(shù)為6×106個。

1.4 用藥時間的擇定 給藥時間根據(jù)中醫(yī)人體晝夜陰陽消長節(jié)律，并結(jié)合現(xiàn)代人體生理晝夜節(jié)律研究結(jié)果，分別于 5∶00～7∶00(下以卯時代稱)，17∶00～19∶00(下以酉時代稱)兩個時間段給藥。

1.5 藥物、試劑與儀器 人參皂苷，總皂甙含量≥80%，上?？稻呕び邢薰井a(chǎn)品(批號:Z060126)。白細胞介素2(IL-2)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒(武漢博士德生物有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)(批號:20060923)，總抗氧化能力(批號:20060920)，谷胱甘肽(GSH)(批號:20060921)，蛋白定量測試盒(購自南京建成生物工程研究所)。酶標儀(美國Bio-Tek公司ELX-800型)，721可見光分光光度計(上海分析儀器總廠)，顯微鏡(日本Olympus倒置光學顯微鏡)，電子天平(上海天平儀器廠JA1003)。

1.6 觀測指標及測量方法 胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的測定:小鼠死后，解剖取出胸腺、脾臟，稱重并計算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)。方法如下:胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/體重(g) ×1 000‰，脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g) ×1 000‰。白細胞計數(shù)，采尾血(10μl)，光學顯微鏡下用計數(shù)板進行白細胞計數(shù)。白細胞介素 2(IL-2)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)按試劑盒說明操作。取出冰凍腫瘤組織，準確稱取腫瘤組織的重量，按重量體積比1∶9加預冷生理鹽水，在冰上勻漿器勻漿，1 500 r/min，離心5 min，離心取組織勻漿上清液測超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力、谷胱甘肽(GSH)，嚴格按試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 人參皂甙擇時治療肝癌小鼠的抗氧化能力的差異觀察 人參皂甙可降低腫瘤組織的谷胱甘肽活性，與用藥時間不同有相關(guān)趨勢，統(tǒng)計無顯著性差異(P＞0.05)。卯時用藥腫瘤組織中的總抗氧化能力顯著降低，SOD濃度顯著升高，有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 人參皂甙擇時治療肝癌小鼠的谷胱甘肽、總抗氧化能力與SOD

2.2 人參皂甙擇時治療對肝癌小鼠細胞因子的差異觀察 與模型組相比，人參皂甙可降低肝癌小鼠的血清 IL-2、TNF-α、VEGF的含量，有顯著性差異(P＜0.05)，但卯時組與酉時組之間無顯著性差異(P ＞0.05)。

表2 人參皂甙擇時治療肝癌小鼠的IL-2、TNF-α與VEGF

2.3 人參皂甙擇時治療對肝癌小鼠的外周血白細胞、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的的差異觀察 人參皂甙可使外周血細胞數(shù)升高，脾臟重量增加，有顯著性差異(P ＜0.05)，與用藥時間無相關(guān)性(P ＞0.05)，對胸腺重量無明顯增重作用(P＞0.05)。

表3 人參皂甙擇時治療肝癌小鼠的外周血白細胞及脾臟、胸腺指數(shù)的變化

3 討論

李時珍·《本草綱目》中提出春夏秋冬季節(jié)不同，所用藥物的寒熱溫涼四氣與升降浮沉應有相應的選擇，一日之時如四季，一日內(nèi)不同時段所用藥物寒熱溫涼四氣與升降浮沉應有相應的選擇。時間藥理學研究亦證實，很多藥物的作用與人體生物節(jié)律有著極其密切的關(guān)系，同一種藥物同等劑量因給藥時間不同，作用也不一樣。在本實驗中觀察到不同時間服用人參皂甙的抗瘤作用不同，卯時用藥的抑瘤作用明顯優(yōu)于酉時用藥，本課題從抗氧化及免疫功能方面探討其作用機制。

人參皂甙具有抗自由基的作用，能降低疲勞小鼠肝組織中恢復期的MDA含量，減少自由基對細胞膜的氧化損傷作用，并且能提高小鼠肝組織中SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的活性［3］，還可以有效地清除長壽命自由基，減輕輻射損傷［4］。本課題實驗結(jié)果顯示人參皂甙可明顯降低小鼠腫瘤組織的總抗氧化能力和谷胱甘肽含量，增高SOD含量，且與用藥時間不同有相關(guān)趨勢，酉時用藥作用弱于卯時用藥。有研究表現(xiàn)誘發(fā)凋亡的因素都是促氧化劑，抑制凋亡的都是自由基清除劑或抗氧化劑，活性氧可使癌逆轉(zhuǎn)或凋亡［5］。

腫瘤壞死細胞可引起炎癥，炎癥又為腫瘤的生長提供良好的環(huán)境，刺激細胞DNA損傷，增加基因不穩(wěn)定性，重塑細胞外基質(zhì)和促進腫瘤血管和淋巴管生成。炎癥通過直接或間接的作用參與了腫瘤血管新生和腫瘤細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移［6］。炎癥有助于腫瘤細胞的增殖和存活，促進腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移，破壞適應性免疫反應［7］。IL-2作為炎癥因子，參與了炎癥過程，隨著IL-2含量和作用的增大，可加重炎癥反應。TNFα又可刺激機體產(chǎn)生一系列炎癥細胞因子(主要為IL家族)的瀑布效應［8］。可見炎性細胞因子在肝癌生長過程中的作用非常重要［9］。且動物實驗研究表明，慢性或急性炎癥時內(nèi)毒素引起的蛋白分解代謝增強可以成為腫瘤惡液質(zhì)的原因［10］。人參為扶正固本、大補元氣之品，有增強免疫、強身健體的作用，對正常動物和免疫功能低下的動物，均有提高免疫功能的作用，能增強非特異性免疫、細胞免疫、體液免疫。本課題實驗結(jié)果顯示人參皂甙可降低血清內(nèi)IL-2、TNFα的水平，抑制體液免疫功能，另一方面，又增強了機體的細胞免疫功能，且在體內(nèi)可明顯降低血清VEGF的含量，與用藥時間無明顯相關(guān)性。提示人參皂甙可能是通過減輕機體的炎癥反應，增強抗應激能力以達到抑制腫瘤生長的作用。

有研究表明，肝癌大鼠的免疫系統(tǒng)節(jié)律已發(fā)生紊亂，機體免疫調(diào)節(jié)失常［11］。人參皂甙不同時間服用對IL-2、TNFα、VEGF等細胞因子血清含量無明顯影響，但不同時間服用對其紊亂節(jié)律調(diào)整作用是否一致，還需進一步研究。

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