杜利霞，董寬虎，朱慧森

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是細(xì)菌、酵母、藻類、動物和高等植物的膜系統(tǒng)上普遍存在的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的pH、Na＋濃度調(diào)節(jié)及細(xì)胞體積變化等生命活動［1，2］。在 GenBank中已經(jīng)注冊的Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列已經(jīng)達(dá)到400多個(gè)，氨基酸序列達(dá)236個(gè)［3］。近年來，Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因以及該基因表達(dá)活性的調(diào)節(jié)機(jī)制，蛋白的結(jié)構(gòu)功能等的研究受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注，特別是隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)該蛋白在植物耐鹽性方面起重要作用。僅從Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生理功能及其與植物耐鹽性關(guān)系方面的研究進(jìn)展進(jìn)行論述。

1 Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分類

1.1 質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

植物Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性首次在大麥中發(fā)現(xiàn)［4］，并定位于質(zhì)膜，質(zhì)膜 Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要與植物對Na＋的外排有關(guān)，是植物抗拒鹽離子毒害的首個(gè)屏障。

在酵母中首次克隆了質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（SOS1）［5］。植物質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因是Shi等［6］2000年首次從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆到，植物中的SOS1定位于葉和根的質(zhì)膜上，分子量為127kDa。在SOS1和其他質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列中，均存在一個(gè)非常保守的Na＋結(jié)合區(qū)，沒有發(fā)現(xiàn)氨氯吡咪（Na＋通道阻斷物）結(jié)合位點(diǎn)［7，8］。其 N末端為一個(gè)疏水結(jié)構(gòu)，可能由10～12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成，跨膜區(qū)和微生物、動物的Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列類似，SOS1序列另一個(gè)特征是它有個(gè)長的親水尾部，將近700個(gè)氨基酸，尾部面向細(xì)胞質(zhì)，就有更多機(jī)會跟那些調(diào)控逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的諸多蛋白相互作用，以此達(dá)到調(diào)節(jié)Na＋/H＋運(yùn)輸，適應(yīng)鹽環(huán)境的目的［7，8］。Shi等［6］利用圖位克隆策略克隆到的質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SOS1基因的研究發(fā)現(xiàn)，該基因位于擬南芥的第2染色體上，具有22個(gè)內(nèi)含子和23個(gè)外顯子，編碼1 146個(gè)氨基酸。

已經(jīng)克隆的植物質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（表1）。在克隆質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因過程中，研究者發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)高等植物的質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均有單基因編碼［10，11］。目前僅在海草（Cymodocea nodosa）［12］和昆諾阿藜（Chenopodium quinoa）［7］中分別克隆到2個(gè)編碼質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。可見，大多數(shù)植物的質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能是一個(gè)單基因家族。

1.2 液泡膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

液泡膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性首次被發(fā)現(xiàn)是在甜菜根部貯藏組織的液泡膜上［13］，之后，許多具有液泡膜Na＋/H＋交換活性的植物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。Nass等［14］在篩選酵母cnb1突變體的抑制子時(shí)，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)與耐鹽性有關(guān)的新基因NHX1，它編碼Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，定位于液泡膜上負(fù)責(zé)將Na＋區(qū)隔化入液泡。將Na＋的區(qū)隔化入液泡，是酵母及植物降低細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Na＋水平的另一途徑，一方面減少了Na＋在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)對細(xì)胞器的毒害作用，另一方面也降低了植物細(xì)胞的滲透勢，有利于植物在高鹽低滲的環(huán)境下吸收水分，維持植物的生長。

表1 克隆的植物質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Table 1 The plasma membrane Na＋/H＋antiporters from some plants

Sardet等［15］完成了第1個(gè)液泡膜 Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NHE）的分子克隆，其氨基酸序列的親水性圖譜顯示Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域是由大約500個(gè)氨基酸形成的12個(gè)跨膜片段組成，這一區(qū)域?qū)a＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物、Na＋的競爭性抑制劑氨氯吡咪及其衍生物敏感，是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)的區(qū)域；與之相連的C末端結(jié)構(gòu)域由大約300個(gè)氨基酸組成，位于細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，此結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有多個(gè)蛋白激酶作用位點(diǎn)，能夠與鈣調(diào)素結(jié)合，參與多種信號反應(yīng)，是調(diào)節(jié)活性的區(qū)域。酵母液泡膜上的Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NHX1）與NHE家族類似，也是內(nèi)在蛋白，N末端結(jié)構(gòu)域含有12個(gè)跨膜的片段，由633個(gè)氨基酸組成［14］。擬南芥的Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AtNHX）與酵母的NHX1以及人的NHE6結(jié)構(gòu)相似，由538個(gè)氨基酸組成［16］。擬南芥液泡膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以分為9個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)親水C端結(jié)構(gòu)域；跨膜區(qū)為疏水，呈螺旋狀，含有Na＋結(jié)合的重要?dú)埢?。這些區(qū)域含有陽離子運(yùn)輸?shù)慕Y(jié)構(gòu)，其中的3個(gè)疏水區(qū)為非跨膜結(jié)構(gòu)，而與液泡膜顯示出一定的關(guān)聯(lián)。其N端處于細(xì)胞質(zhì)中，而幾乎整個(gè)的C端親水區(qū)處于液泡膜內(nèi)［17］。

表2 已克隆的一些植物液泡膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Table 2 The tonoplast membrane Na＋/H＋antiporters from some plants

2 Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能

2.1 Na＋的外排

Na＋從土壤向根中的單向運(yùn)輸有一個(gè)重要特點(diǎn)，就是高速。盡管Na＋的內(nèi)流速率很高，但根部并沒有快速積累Na＋。而且在鹽漬環(huán)境中，隨時(shí)間的延長，根部的Na＋含量變化不大，但地上部分的Na＋含量卻趨向于升高，但速度很慢，這暗示穿過質(zhì)膜的Na＋外流量很大［18］。Na＋外排是避免Na＋在細(xì)胞質(zhì)中積累的一種直接途徑。植物將Na＋排出細(xì)胞外時(shí)需逆著電化學(xué)勢梯度，是一個(gè)主動運(yùn)輸過程。在高等植物中，Na＋的外排是通過質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)，且質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因是高等植物中唯一具備將Na＋排到細(xì)胞外功能的離子平衡調(diào)節(jié)基因［19］。質(zhì)膜 H＋－ATPase（P－ATPase）用水解ATP產(chǎn)生的能量將H＋從細(xì)胞質(zhì)中泵出細(xì)胞，產(chǎn)生跨質(zhì)膜的 H＋電化學(xué)勢梯度，提供能量，從而驅(qū)動質(zhì)膜上的Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使H＋順其電化學(xué)勢進(jìn)入細(xì)胞，Na＋則逆電化學(xué)勢排出細(xì)胞［20］。這一點(diǎn)已經(jīng)得到Vitart等的證實(shí)［21］。

2.2 Na＋區(qū)隔化

無論是鹽生植物還是非鹽生植物的細(xì)胞質(zhì)中酶對Na＋都非常敏感。為了保持胞質(zhì)內(nèi)Na＋的非毒性水平，植物細(xì)胞除了將胞質(zhì)中的Na＋排出細(xì)胞以外，另一個(gè)途徑就是將細(xì)胞質(zhì)中的Na＋區(qū)隔化入液泡。Na＋區(qū)隔化至液泡中后，一方面降低了胞質(zhì)中的Na＋濃度，避免胞質(zhì)中過高Na＋對生理生化代謝的干擾；另一方面還可降低植物細(xì)胞水勢，促進(jìn)植物從外界吸水，從而有利于植物在鹽漬化土壤上的生存。Na＋進(jìn)入液泡是通過液泡膜上的 Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體完成［22，23］。液泡膜上的Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白行使功能需要依賴于液泡膜上的H＋－PPase和H＋－ATPase所產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子電化學(xué)勢梯度為驅(qū)動力，將胞質(zhì)Na＋區(qū)隔化入液泡中。這意味著通過增大液泡膜質(zhì)子泵基因表達(dá)來增大H＋跨膜梯度，可以為液泡膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)Na＋/H＋交換提供更強(qiáng)大的驅(qū)動力，這樣就有可能將細(xì)胞質(zhì)中過多的Na＋區(qū)隔化到液泡內(nèi)腔中，增強(qiáng)細(xì)胞的耐鹽性。該觀點(diǎn)已由Li等［24］證實(shí)，研究過量表達(dá)鹽地堿蓬 Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SsNHX1和擬南芥液泡膜焦磷酸酶基因AVP1的擬南芥植株比野生型擬南芥植株有更強(qiáng)的抗鹽能力。從而證明，鹽脅迫下液泡膜上的Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、H＋－PPase和 H＋－ATPase三者需要協(xié)調(diào)工作，才能最有效的將細(xì)胞質(zhì)中過多的Na＋區(qū)隔化入液泡，這樣，Na＋含量可降低到無毒害水平，從而增加植株的耐鹽性。

2.3 調(diào)節(jié)pH值

SOS1外排Na＋的同時(shí)，將細(xì)胞外的H＋轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)中，使細(xì)胞質(zhì)酸化，從而有利于細(xì)胞質(zhì)中代謝活動的正常進(jìn)行［25，26］。SOS1的 Na＋/H＋轉(zhuǎn)運(yùn)活性受到抑制時(shí)（如SOS1突變），擬南芥根部H＋內(nèi)流受到抑制，細(xì)胞質(zhì)發(fā)生堿化，pH值顯著升高［27］。由此可見，質(zhì)膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有調(diào)控細(xì)胞pH值的功能［28］。Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白影響細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器pH的變化，同時(shí)也影響細(xì)胞生長對環(huán)境pH的要求。如野生型擬南芥的細(xì)胞質(zhì)pH約為7.0，但chx2321突變株則為7.4，突變株在pH 4.0的環(huán)境下較pH 7.0的環(huán)境中生長良好［29］。啤酒酵母在堿性條件下，利用質(zhì)膜Na＋－ATP酶將Na＋泵出胞外，但在酸性環(huán)境下則是利用Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體將Na＋排出細(xì)胞?？梢?，Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)pH的調(diào)節(jié)。

3 Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與耐鹽性的關(guān)系

目前酵母和高等植物的Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白倍受重視，Na＋通過Na＋/H＋的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)在液泡中積累或排除細(xì)胞質(zhì)外是植物耐鹽性的重要機(jī)制［30，31］，是鹽生植物和耐鹽甜土植物的主要特征［32，33］。甜土植物體內(nèi)不存在Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，有無鹽處理都不顯示Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性；耐鹽的甜土植物通過NaCl脅迫誘導(dǎo)出Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性：如75mmol/L NaCl和150mmol/L NaCl處理向日葵，其根部液泡膜微囊上的Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對Na＋的 Km 分 別 為 64mmol/L 和 8mmol/L，而Vmax不變，說明鹽處理沒有改變Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的數(shù)量，只是Na＋激活了已經(jīng)存在的Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［34］；鹽生植物Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性是結(jié)構(gòu)性的，無鹽條件下Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性較低，鹽處理后由于Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成增加，其活性也增加，所以說Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的有無及其活性高低與植物的耐鹽性密切相關(guān)。

土壤鹽漬化是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的最嚴(yán)重的非生物逆境之一，工程措施解決鹽漬化的可能性甚小，因而培育耐鹽的作物品種是未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的有效途徑。對于植物耐鹽工程而言，獲得關(guān)鍵的耐鹽基因尤為重要，Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物抵御鹽脅迫中發(fā)揮著重要作用，這類蛋白可以維持Na＋在植物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，從而減輕過多的Na＋對細(xì)胞造成的毒害。隨著人們對植物耐鹽性機(jī)理的進(jìn)一步了解和分子技術(shù)的提高，對該基因分離、克隆，并轉(zhuǎn)移到非抗鹽的農(nóng)作物中，對與傳統(tǒng)的育種方法結(jié)合，會得到大量的抗鹽性植物新品種改良鹽堿地，經(jīng)濟(jì)效益可觀，應(yīng)用前景廣闊。

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