施 艷，孫 虎，孫炳劍，王振躍

(1.河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，河南鄭州450002;2.河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護所，河南鄭州450002)

甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)是馬鈴薯Y病毒屬的成員之一，已有文獻報道，通過抑制性消減雜交和基因芯片技術(shù)研究寄主對甘蔗花葉病毒的抗性［1］以及SCMV抗性基因的定位［2，3］.已有研究通過抑制性消減雜交技術(shù)研究了病毒侵染后玉米寄主基因的差異表達，并且克隆了其中一個病毒侵染后誘導表達的基因玉米硫氧還蛋白M2，發(fā)現(xiàn)玉米硫氧還蛋白 M2對 SCMV的侵染是起到抑制作用的.硫氧還蛋白是一類相對分子質(zhì)量約為12 kD的小蛋白.所有的硫氧還蛋白都具有一個保守的活性中心，Trp-Cys-Gly(Ala)-Pro-Cys，活性中心中的這2個半胱氨酸起到氧化還原作用［4］.隨著對植物中的硫氧還蛋白特別是擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的硫氧還蛋白研究的深入，硫氧還蛋白在植物中的許多重要作用也逐步顯示出來［5～10］，在水稻中，通過轉(zhuǎn)基因的方法敲除水稻硫氧還蛋白酶的表達，結(jié)果表明，水稻硫氧還蛋白酶在植物的生長和發(fā)育過程中有至關重要的作用［11］.擬南芥硫氧還蛋白m3(Trxm3)主要存在于非綠色組織的質(zhì)體內(nèi)，通過基因突變發(fā)現(xiàn)Trxm3與胞間連絲的調(diào)控有關，Trxm3突變的植株中胞間連絲的分支增多并且胼胝質(zhì)的積累也加強［12］.為了成功建立侵染，病毒通過利用寄主因子來幫助它進行復制和移動.在病毒侵染的不同階段，許多參與寄主新陳代謝、信號轉(zhuǎn)導以及防衛(wèi)反應的基因的表達譜會發(fā)生變化［13～15］，因此，研究病毒侵染后寄主差異表達的基因?qū)⒂兄诹私獠《镜那秩緳C制.本研究采用實時熒光定量PCR方法研究了SCMV侵染后的不同階段玉米硫氧還蛋白M1和M3表達水平的變化，分析玉米中不同硫氧還蛋白M與SCMV侵染的相關性，為進一步深入研究玉米硫氧還蛋白M的在抗病毒反應中的機制提供證據(jù).

1 材料與方法

1.1 植物材料

以玉米(Zea mays L.)品種綜31為試驗材料.

1.2 病毒接種與葉片采集

在人工氣候室種植玉米品種綜31，待玉米長到三葉期選擇長勢好，生長狀態(tài)一致的玉米幼苗分別接種對照0.01 mol·L-1磷酸緩沖液(phosphate buffer，PB)和甘蔗花葉病毒(SCMV)侵染的玉米汁液.

接種后 2，6，10，14 d，分別采取對照接種和SCMV接種的玉米的第1片系統(tǒng)葉，接種后8 d系統(tǒng)葉片上可以觀察到花葉癥狀.

1.3 玉米的RNA提取與cDNA合成

利用 Trizol提取總 RNA，利用 TaKaRa的DNase進行總RNA處理，以質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，利用微量分光光度計Nanodrop檢測RNA的含量和純度.每個樣品取0.5 μg總RNA進行第1鏈cDNA合成，方法參照Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明進行.

1.4 實時熒光RT-PCR引物設計

根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的Trm序列，利用軟件Primer Premier 5.0設計Real-time PCR的內(nèi)參引物和目的片段引物，引物序列見表1.

1.5 實時熒光定量PCR反應體系

Real time PCR應用ABI 7500擴增儀的操作方法.按照 TAKARASYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)的方法操作，反應條件如下:94℃，30 s;94 ℃，5 s;58 ℃，20 s;72 ℃，35 s.40個循環(huán).

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗重復3次，采用Microsoft Excel處理數(shù)據(jù)，用SAS8.2軟件進行統(tǒng)計分析，顯著性測驗在0.05水平進行.

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequence for real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米總RNA質(zhì)量分析及cDNA第1鏈合成

利用Trizol提取總RNA，通過微量分光光度計Nanodrop檢測RNA的濃度和純度(表2).由表2可見，紫外吸光值A260/A280的比值均為1.8～2.0，表明提取的總RNA的純度較高，采用質(zhì)量分數(shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)RNA條帶清晰，沒有拖帶現(xiàn)象，表明提取的總RNA的純度和完整性較好，可以用于實時熒光定量PCR分析.

表2 玉米總RNA純度和質(zhì)量濃度Table 2 Purity and concentration of total RNAmg·L-1

圖1 玉米總RNA瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Agrose gel analysis of total RNA in maize

2.2 實時熒光定量體系的建立

玉米硫氧還蛋白M1(ZmTrm1)在模板量為2.5 mg·L-1時，退火溫度為58℃時擴增曲線的Ct值為22，介于15～30，表明有良好的擴增，融解曲線只有單一的融解峰，表明ZmTrm1是特異性擴增.玉米硫氧還蛋白 M3(ZmTrm3)在模板量為25 mg·L-1時，擴增曲線的Ct值為24，融解曲線顯示單一的融解峰，表明ZmTrm3也是特異性擴增(圖2).

圖2 實時熒光定量PCR擴增的融解曲線Fig.2 Melting curve of real-time PCR

2.3 SCMV侵染后不同階段ZmTrm1和ZmTrm3表達水平分析

通過實時熒光定量PCR分析ZmTrm1在SCMV接種后2，6，10和14 d的表達水平.從圖3和圖4可以看出，在接種后2，6和10 d，SCMV接種葉片與對照接種葉片ZmTrm1和ZmTrm3表達水平差異不顯著，P值均 ＞0.05，在接種后 14 d，SCMV接種的葉片中的ZmTrm1和ZmTrm3表達水平顯著下降.

3 討論

硫氧還蛋白通過調(diào)控二硫鍵的氧化還原作用于一系列的靶標蛋白，從而影響植物的生長發(fā)育，已有報道表明，硫氧還蛋白參與了細胞內(nèi)的維生素合成、蛋白折疊和轉(zhuǎn)運、蛋白降解以及淀粉降解等過程［16～18］，此外，楊樹中的葉綠體硫氧還蛋白 m調(diào)控的過氧化物氧化酶參與了病菌的防衛(wèi)反應［19］.

實時熒光定量PCR已被廣泛地應用于功能基因表達的定量分析［20］，本研究采用SYBR Green I隨機摻入法是根據(jù)熒光染料與DNA雙鏈結(jié)合后釋放熒光的特點而建立的一種實時定量PCR技術(shù)，它的成本相對TaqMan探針法要低，而且不需要探針.由于SYBR Green結(jié)合DNA雙鏈是非特異性結(jié)合，因此非特異性擴增可能會影響實驗結(jié)果，本研究通過對擴增的融解曲線的分析可以發(fā)現(xiàn)，只有單一的融解峰，因此，本試驗設計的引物保證了PCR擴增的特異性以及相對定量的可靠性.

ZmTrm1和ZmTrm3的表達水平在SCMV接種后2，6，10 d與對照沒有顯著差異，而在接種后14 d ZmTrm1和ZmTrm3的表達水平顯著降低，兩者受病毒調(diào)控表達水平的變化不同與ZmTrm2表達水平的變化.已有研究表明，ZmTrm2在接種后10 d顯著上調(diào)表達，對 SCMV的侵染起到抑制作用［21］，而 ZmTrm1和 ZmTrm3 在接種后 10 d 表達水平?jīng)]有顯著變化，只是在SCMV侵染后期表達水平要顯著下降，這可能是由于病毒侵染后期，葉片中葉綠體結(jié)構(gòu)遭受破壞，光合作用變?nèi)跛鸬?硫氧還蛋白M是一種定位于葉綠體中，通過光調(diào)節(jié)碳代謝途徑發(fā)揮作用，因此葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞可能會影響硫氧還蛋白M的表達.硫氧還蛋白是一類重要的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，不同的硫氧還蛋白M在病毒侵染的過程中發(fā)揮了不同的作用，本研究發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白M1和M3在SCMV侵染的后期表達水平顯著降低，通過影響防衛(wèi)反應途徑的相關靶標蛋白發(fā)揮作用，從而間接地影響病毒侵染.

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