周曉靜，白素芬，李 欣，閆鳳鳴

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南鄭州450002)

棉蚜是世界性的棉花重要害蟲.發(fā)生嚴(yán)重時，排泄的蜜露污染棉葉和棉纖維，引起煤污病的發(fā)生，嚴(yán)重降低棉花的產(chǎn)量和品質(zhì).長期以來，世界各國都在致力于棉花抗蚜品種的選育，并力求通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蚜水平高的轉(zhuǎn)基因棉.抗蚜棉的選育必然涉及到抗蚜性鑒定，目前，有關(guān)抗蚜分級標(biāo)準(zhǔn)主要以蚜口密度減退率或蚜害指數(shù)減退率作為依據(jù)［1］.然而，蜜露作為棉蚜代謝的最終產(chǎn)物，1頭棉蚜整個生長發(fā)育階段排泄的蜜露可達(dá)2 220 μg，占其取食總量的70%以上［2］，排蜜量的多少能夠反映棉蚜取食量的大小.已有的研究［3］還表明，蚜蟲蜜露的排泄受寄主植物營養(yǎng)水平的影響顯著，與不同材料的抗性密切相關(guān).田間蚜蟲發(fā)生量大的材料，蚜蟲排蜜量大;相反，排蜜量小.芥蚜取食含有麥胚凝集素(Wheat germ agglutinin，WGA)的人工飼料后，排泄的蜜露減少40%;取食轉(zhuǎn)wga基因的印度芥后，與受體親本相比，排泄的蜜露量顯著下降，說明wga基因的表達(dá)，抑制了蚜蟲的取食.進(jìn)一步的研究表明，伴隨排蜜量的下降，芥蚜的死亡率增加和生殖力下降［4］.國際水稻研究所已將蜜露檢測作為評價水稻材料是否抗褐飛虱的一個簡易指標(biāo).劉光杰等［5］通過白背飛虱(Sogatella furcifera)蜜露量，結(jié)合田間自然蟲量調(diào)查獲得了水稻材料抗白背飛虱的定量指標(biāo)，證明蜜露量測定法可以用來測定水稻材料對白背飛虱的抗性水平.由此可見，蜜露可以反映寄主植物對蚜蟲、飛虱等昆蟲取食的影響，檢測其排泄的蜜露量，可以作為評價寄主抗性的一個重要指標(biāo).有關(guān)蜜露量的測定方法較多，如蜜露滴計數(shù)法、蜜露色斑面積法即半定量法、稱量法和比色法等.但是，何種方法更準(zhǔn)確、有效、簡易未見詳細(xì)報道.本研究采用半定量法、稱量法和比色法，比較了棉蚜取食不同轉(zhuǎn)基因棉花后排泄的蜜露量，以期篩選出簡便、準(zhǔn)確的蜜露檢測方法，為轉(zhuǎn)基因抗蚜棉或棉花抗蚜材料的選育提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 供試棉花

供試棉花材料10個，即轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉H2和其親本中棉12，轉(zhuǎn)Bt和CpTI基因抗蟲棉中棉41和其親本中棉23，轉(zhuǎn)凝集素基因抗蟲棉8008和其親本蘇006，轉(zhuǎn)凝集素基因抗蟲棉8009和其親本蘇011，轉(zhuǎn)基因抗蟲雜交棉晉棉34和常規(guī)棉太8作為棉蚜的取食寄主.10個棉花材料均在室內(nèi)同期播種于花盆中，栽培、管理措施一致，苗期用于試驗.

1.2 供試?yán)ハx

棉蚜于2011－06采自河南原陽農(nóng)科院試驗基地.棉蚜飼養(yǎng)方法參照劉樹生［6］的新的葉子圓片法加以改進(jìn)，即將20 mL瓊脂培養(yǎng)基(每1 L蒸餾水加2.5 mg 100萬單位硫酸鏈霉素，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂配制而成)倒入容器內(nèi)，容器選用無毒、透明的塑料杯，口徑為8.7 cm，底部直徑為5.5 cm，高為4 cm.然后將整片棉葉的正面貼在培養(yǎng)基表面，接蚜后，將整個容器倒扣在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿上.置于(25±1)℃，相對濕度60% ～70%，光周期L∶D=14∶10的人工氣候培養(yǎng)箱中飼養(yǎng).用此法飼養(yǎng)的棉蚜與在棉株上自然生長的棉蚜的個體大小和壽命沒有明顯差異，而且棉葉在培養(yǎng)基上能夠保綠10 d以上.

1.3 蜜露的檢測

1.3.1 半定量法－蜜露色斑面積法 在棉花苗期，挑取室內(nèi)各棉花材料上飼養(yǎng)10代的無翅雌成蚜接在相應(yīng)棉花材料葉片的背面(如前述，采用離體葉片飼養(yǎng)法)，每個培養(yǎng)皿內(nèi)留5頭初產(chǎn)仔蚜作為初始蚜，當(dāng)若蚜發(fā)育至3齡或4齡時，在棉葉下方的培養(yǎng)皿內(nèi)鋪上經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的茚三酮浸泡并烘干的濾紙，24 h后取出濾紙，拍照并用九宮格坐標(biāo)紙測量濾紙上斑點面積.每個棉花材料重復(fù)3次.

1.3.2 定量法－稱量法 在棉花苗期，挑取室內(nèi)各棉花材料上飼養(yǎng)10代的無翅雌成蚜，接在相應(yīng)材料棉花葉片的背面，每個培養(yǎng)皿內(nèi)留15頭初產(chǎn)仔蚜作為初始蚜，當(dāng)若蚜發(fā)育至2齡時，在棉葉下方的培養(yǎng)皿內(nèi)放置已稱重的Parafilm膜，72 h后取出膜用電子天平稱重(精確度0.000 1 g)，2次膜質(zhì)量的差值即棉蚜取食該棉花材料后排泄的蜜露量.

1.3.3 比色法

1.3.3.1 氨基酸最大吸收峰的確定 稱量2.879 mg脯氨酸溶于 300 μL 溴甲酚綠(0.001 g·mL－1)，再加3 mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇后用Spectrum756型紫外可見分光光度計在570～700 nm波長范圍內(nèi)比色，以確定氨基酸最大吸收峰的波長.1.3.3.2 棉蚜不同種群密度的排蜜量 分別接50，80，110頭3齡若蚜于中棉12的棉葉上，在棉葉下方鋪Parafilm膜，48 h后取出膜，用300 μL溴甲酚綠分2次在膜上收集蜜露再轉(zhuǎn)移到試管中，再用3.4 mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇分2次洗脫后集中在試管中，用紫外可見分光光度計測其在628 nm下的吸光度值.

1.3.3.3 棉蚜取食不同棉花材料后排蜜量的檢測

在供試的10個棉花材料的棉葉上接成蚜，待其產(chǎn)夠15頭若蚜后移除成蚜，當(dāng)若蚜發(fā)育至2齡時，在棉葉下方放置Parafilm膜收集蜜露，72 h后取出膜，排蜜量測定方法同 1.3.3.2.

1.4 數(shù)據(jù)分析

各處理平均數(shù)間的比較采用Duncan’s新復(fù)極差法.

棉蚜排蜜量減少率X=［Y1(OD對照受體親本)－Y2(OD轉(zhuǎn)基因棉)］/X1(對照受體親本上的棉蚜數(shù)).

2 結(jié)果與分析

2.1 半定量法反映棉蚜取食不同轉(zhuǎn)基因棉后排蜜量的變化

棉蚜在取食所有供試的10個棉花材料后均能正常排泄蜜露，排泄蜜露量的多少與取食量大小呈正比.通過半定量法即測量棉蚜取食后排泄蜜露的色斑面積，即可從蜜露色斑的面積差異反映其取食量的差異.

由表1可以看出，供試的10個棉花材料對棉蚜的取食產(chǎn)生不同的影響，反映在棉蚜取食后蜜露的排泄量呈現(xiàn)差異，它們對棉蚜的適合性依次為中棉12＞8009＞中棉41＞H2＞蘇011＞中棉23＞8008＞蘇006＞晉棉34＞太8，其中中棉12最適合棉蚜的取食，其上棉蚜的排蜜量最高，蜜露色斑面積為105.67 mm2.與之相反，常規(guī)棉太8對棉蚜取食有一定的抑制作用，其上棉蚜的排蜜量最少，僅為18.67 mm2.取食轉(zhuǎn)外源凝集素基因棉8008，與其親本蘇006相比，棉蚜排蜜量增多，說明該凝集素并未發(fā)揮抗蚜作用.以上各轉(zhuǎn)基因棉與其受體親本相比，除8008與其親本蘇006外，抗蚜性差異均未達(dá)到顯著水平.

表1 取食不同轉(zhuǎn)基因棉對棉蚜排蜜量的影響Table 1 Effects of different transgenic cottons on the honeydew excretion by Aphis gossypii

2.2 稱量法反映棉蚜取食不同轉(zhuǎn)基因棉后排蜜量的變化

待棉蚜在各供試棉花材料上取食一定時間后，富集在膜上的蜜露量積累到可以檢測的水平，此時稱量膜的質(zhì)量，獲得棉蚜的排蜜量.

由表2得出，取食中棉12棉蚜的排蜜量最高，取食太8排蜜量最少，取食轉(zhuǎn)外源凝集素基因棉8008，與其親本蘇006相比，排蜜量更多，更適合棉蚜的取食.該結(jié)果與上述半定量法的測定結(jié)果基本一致，說明稱量法和半定量法均能較好的反映棉花材料或轉(zhuǎn)基因棉對棉蚜取食后蜜露分泌的影響.

表2 棉蚜取食10個棉花材料后的排蜜量Table 2 The amount of honeydew production by Aphis gossypii feeding on ten cotton varieties

2.3 比色法反映取食不同轉(zhuǎn)基因棉后對棉蚜排蜜量的影響

2.3.1 氨基酸最大吸收峰波長的確定 為確定溴甲酚綠比色法測定氨基酸的最大吸收峰時的波長，在波長范圍570～700 nm條件下進(jìn)行測定，如圖1顯示，氨基酸最大吸收峰時的波長為628 nm，故選擇628 nm為測定波長.

圖1 不同波長下脯氨酸的吸光度值Fig.1 The absorbance value of proline at different wave length

2.3.2 蚜口密度與棉蚜排蜜量的相關(guān)性 理論上，棉蚜蚜口密度與其排泄的蜜露量呈正相關(guān)性，即蚜口密度高時，排蜜量大;否則，排蜜量小.

由圖2可知，采用比色法很好地反映了棉蚜在不同蚜口密度的排蜜量，排蜜量與蚜口密度的回歸方程為:y=0.013 5x－0.532 3.x為蚜蟲數(shù)量，y為吸光度值.

圖2 棉蚜不同蚜口密度與其排蜜量的相關(guān)性Fig.2 The relationship between aphid density and honeydew production

二者成顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.998 8.由此可見，用此法可檢測棉蚜取食不同棉花材料或轉(zhuǎn)基因棉后，蚜口密度的增長情況，排蜜量大，則相應(yīng)的蚜口密度也高;相反，則蚜口密度低.

根據(jù)棉蚜排蜜量與蚜口密度的相關(guān)性，可以計算出蚜口密度減退率達(dá)20%時，棉蚜排蜜量的減少率 X=0.002 7.

其中，X=［Y1(OD對照受體親本)－Y2(OD轉(zhuǎn)基因棉)］/X1(對照受體親本上棉蚜數(shù)).

蚜口密度減退率為80%時，棉蚜排蜜量的減少率為 X=0.010 8.

由此推測出轉(zhuǎn)基因棉抗蚜分級標(biāo)準(zhǔn)見表3.

2.3.3 棉蚜取食不同轉(zhuǎn)基因棉后排蜜量的變化采用溴甲酚綠比色法測定棉蚜取食各轉(zhuǎn)基因棉后的排蜜量，結(jié)果見表4.

表3 轉(zhuǎn)基因棉對棉蚜抗性分級標(biāo)準(zhǔn)(排蜜量減少率)Table 3 The criterion of resistant classification of transgenic cottons to aphid(reduction of honeydew excretion by Aphis gossypii)

表4 棉蚜取食不同轉(zhuǎn)基因棉后的排蜜量Table 4 The amount of honeydew production by Aphis gossypii feeding on different transgenic insect resistant cottons

由表4可知，棉蚜取食中棉12的排蜜量最大，而取食太8后排蜜量最小，取食其他材料后的排蜜量與上述半定量法和稱量法的趨勢基本一致，這表明3種方法檢測不同棉花材料對棉蚜取食的影響基本吻合，從供試的10個棉花材料中可以反映出中棉12的抗蚜性最低.

綜合分析上述3種蜜露檢測法，均能很好地反映供試的棉花材料對棉蚜取食后蜜露代謝的影響，由此能較準(zhǔn)確地篩選出具有抗蚜能力的材料.相比之下，比色法因其準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、簡單方便和靈敏的特點而優(yōu)于其他2種檢測法.

3 結(jié)論與討論

很多以刺吸植物韌皮部汁液為食的同翅目昆蟲如蚜蟲、飛虱、粉虱等以蜜露的方式將多余的養(yǎng)分如氨基酸和糖分排出體外，排蜜量的多少與其取食的寄主植物的抗生性密切相關(guān)，蜜露檢測因而成為鑒定植物抗性水平的重要途徑.蜜露的主要成分是糖和氨基酸，因此，國內(nèi)外很多研究者多用溴甲酚藍(lán)(綠)和茚三酮法進(jìn)行檢測，并以排蜜量減少的程度反映轉(zhuǎn)基因作物對昆蟲取食的影響.用溴甲酚綠顯色法，NAGADHARA等［7］發(fā)現(xiàn)取食轉(zhuǎn) gna基因水稻的白背飛虱排泄的蜜露量減少了88%，與對照受體親本相比，差異達(dá)極顯著水平 (P＜0.01).同樣，用茚三酮法也證實了芥蚜取食轉(zhuǎn)wga基因的芥后，排泄的蜜露減少，這說明表達(dá)的WGA抑制了芥蚜的取食［4］.此外，將收集的蜜露通過蛋白印跡法還能檢測出取食昆蟲排泄的蜜露中是否含有外源凝集素.與取食未轉(zhuǎn)化的親本相比，只有取食轉(zhuǎn)wga基因芥的芥蚜排泄的蜜露中才能檢測出WGA，這說明該植物韌皮部汁液中確實有表達(dá)的WGA，進(jìn)而也表明，有未經(jīng)消化的WGA從芥蚜腸道排出［4］.蜜露成分分析主要是對蜜露中糖和游離氨基酸的定性和定量分析.楊益眾等［8］研究了棉蚜取食2個轉(zhuǎn)Bt基因棉和1個轉(zhuǎn)Bt及CpTI基因棉后，發(fā)現(xiàn)蜜露的排泄與取食對照親本相比分別減少22.67%，40.54% 和 30.0%，棉蚜取食轉(zhuǎn)基因棉花后蜜露中游離氨基酸的總量均高于對照親本，蜜露中可溶性總糖、蔗糖和各種氨基酸含量在取食轉(zhuǎn)基因棉和常規(guī)棉花材料間存在一定差異.分析刺吸式口器昆蟲取食轉(zhuǎn)基因抗蟲作物后的排蜜量及其營養(yǎng)成分的變化，可以探討轉(zhuǎn)基因作物對刺吸式昆蟲取食和代謝的影響，從而成為鑒定和篩選轉(zhuǎn)基因作物抗蟲性的重要檢測指標(biāo).

蜜露作為反映作物材料或轉(zhuǎn)基因作物的抗蚜性指標(biāo)已被廣泛認(rèn)可.縱觀國內(nèi)外采用的幾種檢測方法，作者進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)蜜露色斑面積法、稱量法和比色法均能反映各供試棉花材料的抗蚜性差異，所測結(jié)果反映的抗蚜性差異基本一致，說明這些方法均可以加以應(yīng)用.但是，測量蜜露色斑面積時發(fā)現(xiàn)，即便面積相同，色斑卻深淺不一，這說明含量的差異被忽略了.稱量法則需達(dá)到天平的檢測范圍，這需要相對較長的接蚜?xí)r間或較大的蚜口密度.而比色法則無上述問題，操作既簡便，又比較精確.而且，用該法還能反映棉蚜排蜜量與蚜口密度的關(guān)系，呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.998 8，經(jīng)與抗蚜性級別的轉(zhuǎn)換，能推測出相應(yīng)的抗蚜評價標(biāo)準(zhǔn).探索出快速、準(zhǔn)確、簡易的蜜露檢測方法將為轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲性評估提供重要的簽定依據(jù).

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