田 博 周和政 張紹陽 陳云輝

Leber遺傳性視神經(jīng)病變(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)是一種引起患者嚴(yán)重視功能障礙的母系遺傳性疾病，由線粒體DNA突變引起并與三個(gè)原發(fā)性突變位點(diǎn)(G11778A、T14484C、G3460A)密切相關(guān)，主要為男性發(fā)病。T14502C作為繼發(fā)性突變位點(diǎn)與G11778A位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)在LHON家系中，國內(nèi)相關(guān)報(bào)道罕見，因此本研究就發(fā)現(xiàn)的T14502C突變位點(diǎn)家系的臨床資料及相關(guān)分子生物學(xué)特征展開研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本家系來自于江西省鷹潭市，先證者為一位18歲男性患者，以“雙眼視力逐漸下降8 a”為主訴就診，8 a前，該患者無明顯誘因出現(xiàn)右眼霧視，辨色困難，之后1周，上述癥狀逐漸加重，且左眼也出現(xiàn)相同癥狀，發(fā)病過程中無眼痛、頭痛、惡心、嘔吐等其他不適。眼科檢查:雙眼視力均為數(shù)指/眼前且不能矯正，眼壓:右眼17 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)，左眼15 mmHg，眼前節(jié)檢查未見明顯異常。直接檢眼鏡檢查可見:雙眼視盤蒼白，C/D為0.5～0.6，盤周血管數(shù)量少，視網(wǎng)膜血管略細(xì)，黃斑區(qū)中心反光可見。雙眼視野(Carl Zeiss Meditec HFAⅡ，Central 30-2 Threshold Test)均表現(xiàn)為大片盲區(qū)，僅存10°左右視島。了解患者家族史可知其連續(xù)三代16位家族成員中3人患病，1人為高度可疑患者但已故(因親屬代述其癥狀與家系患病高度相似，且先證者與其同父同母)，均為男性，因此對先證者擬診為LHON并對此家系15位成員進(jìn)行了基因檢測及眼科相關(guān)檢查，家系圖見圖1。

Figure 1 Pedigree structure of this family with LHON.Patients were indicated by filled squares symbols，and normal subjects were shown with empty symbols.Arrow indicated the proband LHON家系圖。圖中患病者為實(shí)心標(biāo)記，表型正常者為空心標(biāo)記，箭頭所指為先證者

1.2 線粒體DNA突變檢測方法 在15例家系成員知情同意的前提下，抽取每位成員外周靜脈血2 mL，密度梯度離心法分離和純化外周血單個(gè)核細(xì)胞，改進(jìn)高鹽法提取細(xì)胞mtDNA，根據(jù)三個(gè)原發(fā)性突變位點(diǎn)(G3460A、G11778A、T14484C)的堿基座位，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化后由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向堿基序列檢測。

2 結(jié)果

2.1 突變位點(diǎn)檢測結(jié)果 15例家系成員中均未發(fā)現(xiàn)攜帶G3460A和T14484C兩個(gè)突變位點(diǎn)，10例母系成員同時(shí)攜帶有G11778A和T14502C兩個(gè)突變位點(diǎn)，其中的 3例為 LHON患者。G11778A和T14502C兩個(gè)突變位點(diǎn)的野生型及突變型DNA測序圖分別見圖2-圖5。

Figure 2 Identification of G11778A mutation(mutant).Figure 3 Identification of G11778A mutation(wild-type).Figure 4 Identification of T14502cmutation(mutant).Figure 5 Identification of T14502cmutation(wild-type) 圖2 G11778A位點(diǎn)DNA測序圖(突變型)。圖3 G11778A位點(diǎn)DNA測序圖(野生型)。圖4 T14502C位點(diǎn)DNA測序圖(突變型)。圖5 T14502C位點(diǎn)DNA測序圖(野生型)

2.2 眼科檢查結(jié)果 家系中的3例患者均為男性，發(fā)病年齡為10～17歲，平均13歲，患眼視力均≤0.01且不能矯正，除先證者雙眼發(fā)生視力下降時(shí)間相隔1周外，其余兩位患者雙眼同時(shí)漸進(jìn)性視力下降，且僅先證者出現(xiàn)色覺障礙。3位患者雙眼眼底熒光素血管造影檢查顯示:雙眼視盤盤面毛細(xì)血管始終未見熒光充盈，晚期僅見盤沿?zé)晒庵?。無熒光遮蔽，視網(wǎng)膜血管無滲漏。通過了解病史得知患者均未進(jìn)行神經(jīng)營養(yǎng)及血管擴(kuò)張藥物治療。3例患者臨床信息見表1。

表1 3例發(fā)病者的臨床信息總結(jié)Table1 Summary of clinical data for 3 affected individuals

3 討論

目前為止發(fā)現(xiàn)的LHON均為母系遺傳，易于累及青壯年男性，第一個(gè)與之相關(guān)的線粒體DNA突變位點(diǎn)G11778A在1988年由Wallace等［1］首先報(bào)道。隨后G3460A和T14484C位點(diǎn)相繼被發(fā)現(xiàn)［2-3］，此三個(gè)主要的原發(fā)性突變位點(diǎn)位于編碼呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的基因序列中，與臨床上95%的LHON病例密切相關(guān)，而在中國LHON患者中，又以G11778A突變位點(diǎn)為主(90.9%)，相比之下，G3460A及T14484C突變位點(diǎn)在我國LHON患病人群中所占比例較低［4-6］。但即使如此，攜帶同一個(gè)位點(diǎn)G11778A的中國家系，其各自的外顯率、性別比例、成員發(fā)病及預(yù)后情況也不盡相同［7-8］。因此，對于尋找其他可能導(dǎo)致LHON外顯率差異、顯著性別偏倚、相同位點(diǎn)但不同視力損害程度的因素成為這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，包括繼發(fā)性突變位點(diǎn)、線粒體基因組遺傳異質(zhì)性、線粒體單倍體型、核基因背景、生活習(xí)慣和環(huán)境因素等。Johns等［3］對英國8個(gè)攜帶G11778A突變的LHON家系進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，患病者自身攜帶的突變線粒體基因組比例高達(dá)96%，而在一些未發(fā)病攜帶者這一比例不足80%。而國內(nèi)有研究表明，攜帶G11778A突變的中國家系之間的線粒體基因組異質(zhì)性差異對發(fā)病率及視力無明顯影響［7］。因此，繼發(fā)性突變位點(diǎn)對LHON發(fā)病以及預(yù)后的影響成為我們關(guān)注的因素。

在此研究中，我們對一個(gè)LHON中國漢族家系成員進(jìn)行了眼科檢查、線粒體基因位點(diǎn)檢測，發(fā)現(xiàn)該家系患病成員共同特點(diǎn)是以嚴(yán)重的視力損害為主，未發(fā)現(xiàn)合并其他眼科疾病以及耳聾、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。家系中攜帶者的突變位點(diǎn)為G11778A及T14502C，除先證者雙眼發(fā)生視力下降時(shí)間相隔1周外，其余兩位患者均雙眼同時(shí)漸進(jìn)性視力下降，不伴眼痛等其他不適，且迄今為止3例患者均未出現(xiàn)視力恢復(fù)情況，這一情況與國外對攜帶G11778A位點(diǎn)家系報(bào)道情況相一致，即患者視力損害最嚴(yán)重，恢復(fù)或好轉(zhuǎn)者罕見，預(yù)后差［9］。3例患者眼底熒光血管造影并未表現(xiàn)為病程早期典型的視神經(jīng)盤周圍的淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張，視網(wǎng)膜血管迂曲擴(kuò)張等［10］，推測可能與病程較長視神經(jīng)已萎縮有關(guān)。

Zhang等［11］對同時(shí)攜帶 T14484C和 T14502C的一個(gè)四代中國家系研究后發(fā)現(xiàn):患者發(fā)病較早，9位患者年齡均介于16～18歲之間，且所有母系家族成員均呈現(xiàn)典型的LHON臨床特征，外顯率達(dá)100%。而相比之下，單獨(dú)攜帶T14484C突變位點(diǎn)的3個(gè)中國家系外顯率卻只有27% ～60%［12］。提示T14484C突變本身并不足以導(dǎo)致家系內(nèi)所有攜帶者發(fā)病，在發(fā)病過程中T14502C突變起到協(xié)同作用。王燕等［5］報(bào)道110例中國人G11778A突變患者中17.6%視力低于0.01，52.1%發(fā)病視力介于0.01與0.10之間，30.3%視力高于0.10，最終6.8%患者視力有所恢復(fù)。但本研究家系中所有患者視力均低于0.01，且迄今為止未見任何視功能恢復(fù)情況。發(fā)病年齡方面，平均發(fā)病年齡13歲，雖例數(shù)較少，但可觀察到本家系患者發(fā)病年齡均未達(dá)18歲，明顯比單獨(dú)攜帶G11778A位點(diǎn)的中國家系的發(fā)病年齡19.3歲低［13］。T14502C與 T14484C堿基突變位點(diǎn)同位于ND6基因，因此相比較之下，如果突變位點(diǎn)的空間距離能夠削減其協(xié)同作用，即使T14502C與位于ND4基因的G11778A位點(diǎn)的協(xié)同作用稍弱，根據(jù)上述分析，這種作用仍可能存在。Zhang等［14］研究認(rèn)為，T14502C突變能夠增加LHON中國家系的外顯率，但與文獻(xiàn)報(bào)道的G11778A家系外顯率33%～60%［9，15］相比，并未觀察到本家系外顯率顯著升高(33%)，且本家系中患病者均為男性，性別偏倚更為突出。

ND6基因編碼產(chǎn)物參與組成質(zhì)子遷移模塊，目前認(rèn)為ND6基因參與呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ早期裝配過程，對于呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的膜壁裝配以及結(jié)構(gòu)的維持不可或缺［16］，ND4基因參與之后的大量中間亞單位裝配后的過程［17］。因此ND6與ND4基因?qū)τ诤粑湉?fù)合物Ⅰ的正確裝配均具有十分重要的意義。T14502C突變引起ND6基因編碼產(chǎn)物中纈氨酸代替了異亮氨酸，其在種屬進(jìn)化中并不保守。Chalmers等［13］認(rèn)為，線粒體繼發(fā)性點(diǎn)突變可能只是基因組的單核苷酸多態(tài)性，并不對疾病本身產(chǎn)生影響。但綜合以上研究結(jié)果分析可知此突變?nèi)钥赡苡绊懥薒HON的性別比例及臨床預(yù)后等方面。本家系調(diào)查局限性在于因家系成員配合原因，更多的旁系成員無法統(tǒng)一接受調(diào)查研究，因此此次調(diào)查對象數(shù)量有限。據(jù)患者Ⅲ1描述，其家族遠(yuǎn)親也同樣存在相同癥狀患者，進(jìn)一步的研究應(yīng)擴(kuò)大家系范圍，同時(shí)各成員生活習(xí)慣及環(huán)境因素是否參與發(fā)病，值得我們進(jìn)一步探討。

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