王 卓， 高長明， 吳建中， 丁建華， 李蘇平， 馬 蓉， 王 潔， 劉燕婷， 曹海霞

惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康，對其病因的大量研究表明既有環(huán)境因素的作用，也有遺傳因素的作用。業(yè)已證明，腫瘤發(fā)生發(fā)展涉及的基因常與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等有關(guān)，腫瘤已是公認(rèn)的基因疾病。胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國是胃癌高發(fā)區(qū)，每年約有40萬新發(fā)病例，30萬人死于胃癌，發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤的第三位［1］。JWA基因是由Chen等［2］率先發(fā)現(xiàn)和克隆的新的環(huán)境應(yīng)答基因，具有活躍的生物學(xué)功能。近期研究發(fā)現(xiàn)JWA基因多態(tài)性與中國漢族人群患膀胱癌［3］、食管癌［4］和白血病［5-6］等多種惡性腫瘤的危險性有關(guān)。我們檢測分析胃癌患者及其相應(yīng)對照人群的 JWA T723G多態(tài)性，以探討其與胃癌易感性的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 研究對象和標(biāo)本收集 1999年8月至2000年9月，在淮安市楚州區(qū)人民醫(yī)院隨機收集經(jīng)組織病理學(xué)確診的胃癌107例，同時在患者居住的村鎮(zhèn)收集相似年齡(相差≤5歲)且無癌癥病史的一般人群200名為對照組，抽靜脈血標(biāo)本。血標(biāo)本置乙二胺四乙酸鈉抗凝管，分離白細(xì)胞層。用 QIAamp DNA提取試劑盒提取白細(xì)胞DNA，DNA置－30℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因型分析 采用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和變性高效液相色譜法 (denaturinghigh performence liquid chromatography，DHPLC)對JWA 723 T/G多態(tài)性位點進行分析。擴增引物為Takara公司合成，上游引物為5'-CTTCGGAACCTCAAGAACAAAC-3';下游引物為 5'-TCTGAGGTCTTCTCTCTGAAACATC-3'。PCR反應(yīng)體系總體積均為 25 μL，含有引物 10 pmol，4 × dNTPs 0.25 mmol/L，MgCl22.0 mmol/L，10 × Buffer 2.5 μL，熱啟動 Taq酶1 U 及 0.5 μL基因組 DNA。擴增反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性7 min;95℃ 30 s，62℃30s，72℃ 30 s，共 35 個循環(huán);72℃延伸 5 min，94℃變性4 min后，再將 PCR產(chǎn)物的溫度按0.1℃/s的梯度降低到25℃，置4℃冰箱保存。

PCR產(chǎn)物直接上樣到DHPLC儀(WAVE 3500，Transgenomic，USA)進行基因型鑒定。流動相為0.1mol/L的N-三乙基乙酰胺(TEAA，分析純)和不同濃度梯度的乙晴，流速為0.9 mL/min，application type選擇為mutation，按照儀器設(shè)定的洗脫梯度走樣。雜合子基因型可從DHPLC圖形直接確定，野生型純合子和變異型純合子的DHPLC圖形相同，需與已知純合型混合，經(jīng)過變性和復(fù)性過程，再次上樣DHPLC儀分析確定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS軟件和EpiInfo軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，以比值比(odds ratios，OR)及其95%可信區(qū)間(95%confidence interval，95%CI)表示相對危險度，以多因素非條件Logistic回歸模型計算調(diào)整OR及其95%CI，計算時調(diào)整了性別和年齡。用Mantel-Haenszel χ2檢驗基因型頻率分布差異和相對危險度的統(tǒng)計學(xué)意義，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 胃癌與對照組的均衡性檢驗 對照組男、女分別為132例和68例，平均年齡分別為(60.76±8.46)歲和(58.72 ±9.54)歲;胃癌組男、女分別為84例和23例，平均年齡分別為(61.35±7.75)歲和(60.17±9.89)歲。對照組與胃癌組之間的性別及年齡分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

2.2 胃癌組與對照組的遺傳平衡檢驗及基因型分布 JWA T723G被區(qū)分為T/T，G/G，T/G三種基因型。對照組中7例未檢出，病例組中5例未檢出。病例組JWA 723的T/T、T/G和G/G基因型的分布頻度分別為56.86%、38.24%和4.90%，對照組分別為65.80%、30.57%和3.63%，兩組間的基因分布頻度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.290，P=0.318)。對胃癌組和對照組的基因型頻率進行了遺傳平衡檢驗，兩組的基因型頻率觀察值與期望值差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為 0.31和 0.002 3，均 P ＞0.05)，表明胃癌組和對照組的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg比例，樣本具有代表性。

在調(diào)整了性別和年齡后，與T/T基因型相比，T/G基因型發(fā)生胃癌的危險性上升到1.21(95%CI:0.94～1.57)，G/G基因型發(fā)生胃癌的危險性上升到1.49(95%CI:0.45 ～4.96)。合并 T/G 和 G/G基因型分析顯示G等位基因發(fā)生胃癌的危險性上升到 1.21(95%CI:0.95 ～1.55)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.131 6)，具體見表 1。

表1 JWA T723G基因型頻率分布與胃癌易感性的關(guān)系

3討論

基因多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是人類基因變異的最普通形式，可能有助于解釋不同個體對多種疾病包括癌癥的易感性差異，但其根本的分子機理仍不清楚。如果DNA序列中單核苷酸的變異，尤其是基因啟動子的突變可能既影響基因表達(dá)又影響酶的活性，就較容易和癌癥危險性聯(lián)系起來。

JWA基因在人染色體的定位于3p14(NT_022423.12)，JWA在大多數(shù)真核生物細(xì)胞中均有較高的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，其啟動子序列中含有多種順式反應(yīng)元件(包括應(yīng)激反應(yīng)元件、佛波酯反應(yīng)元件、高鐵血紅素反應(yīng)元件和熱休克反應(yīng)元件)，且廣泛參與細(xì)胞對多種環(huán)境理化因素(如熱休克、非電離輻射、氧化應(yīng)激、多種分化誘導(dǎo)刺激、多種環(huán)境化學(xué)污染物等)的應(yīng)答反應(yīng)，這些反應(yīng)元件是否參與JWA轉(zhuǎn)錄調(diào)控及具體的轉(zhuǎn)錄機理仍不清楚。JWA基因SNPs位點的存在可能是個體易感性差異的一個標(biāo)志，SNPs位點可能影響JWA對各種環(huán)境刺激的應(yīng)答反應(yīng)，對DNA損傷和修復(fù)過程產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，最終引發(fā)腫瘤的產(chǎn)生。

JWA T723G多態(tài)性位點位于JWA mRNA 3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)?，F(xiàn)在還不清楚JWA 3’-UTR基因多態(tài)性對酶的結(jié)構(gòu)和功能有什么影響，雖然基因的3’非翻譯區(qū)并不翻譯成蛋白，但其常在維持mRNA穩(wěn)定性方面起重要作用。如果mRNA二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，翻譯就會被影響，因此該基因多態(tài)性有可能導(dǎo)致酶活性或功能的改變。

我們以前的研究發(fā)現(xiàn)JWA T723G多態(tài)性與食管癌易感性相關(guān)［7］。然而，湯唯艷等［8］研究發(fā)現(xiàn)JWAT723G多態(tài)性與發(fā)生消化道腫瘤的危險無關(guān)，這與我們此次的研究結(jié)果相同，原因可能為不同類型腫瘤發(fā)生機理并不完全一致，從而導(dǎo)致 JWA T723G多態(tài)性在不同腫瘤中表現(xiàn)出的易感性也不相同?？傊覀兊难芯堪l(fā)現(xiàn)，JWA T723G多態(tài)性與胃癌易感性不相關(guān)，JWA T723G多態(tài)性位點可能不是胃癌個體易感性差異的一個標(biāo)志。

［1］Yang L.Incidence and mortality of gastric cancer in China［J］.World J Gastroenterol，2006，12(1):17-20.

［2］Chen R，Li A，Zhu T，et al.JWA—a novel environmental responsive gene，involved in estrogen receptor-associated signal pathway in MCF-7 and MDA-MB-231 breast carcinoma cells［J］.J Toxicol Environ Health A，2005，68(6):445-456.

［3］Li CP，Zhu YJ，Chen R，et al.Functional polymorphisms of JWA gene are associated with risk of bladder cancer［J］.J Toxicol Environ Health A，2007，70(11):876-884.

［4］Tang WY，Wang L，Li C，et al.Identification and functional characterization of JWA polymorphisms and their association with risk of gastric cancer and esophageal squamous cell carcinoma in a Chinese population［J］.J Toxicol Environ Health A，2007，70(11):885-894.

［5］Shen Q，Tang WY，Li CP，et al.Functional variations in the JWA gene are associated with increased odds of leukemias［J］.Leuk Res，2007，31(6):783-790.

［6］Zhu YJ，Li CP，Tang WY，et al.Single nucleotide polymorphism of the JWA gene is associated with risk of leukemia:a case-control study in a Chinese population［J］.J Toxicol Environ Health A，2007，70(11):895-900.

［7］王卓，高長明，丁建華，等.JWA G723T多態(tài)性與食管癌易感性［J］.中國腫瘤外科雜志，2011，3(2):96-98.

［8］湯唯艷，繆珩，李春平，等.JWA基因多態(tài)性與消化道腫瘤易感性關(guān)系的研究［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006，26(8):640-644.