精神分裂癥的病因十分復(fù)雜，遺傳與環(huán)境因素之間復(fù)雜的相互作用可能是精神分裂癥的主要病因［1］，表觀遺傳修飾能反映這種復(fù)雜的相互關(guān)系［2］。表觀遺傳修飾以DNA甲基化最為常見［3］。目前精神分裂癥的DNA甲基化研究較多的基因包括顫蛋白（reelin），5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（5-HTT），DRD2，等［4－7］，其中DRD2基因是精神分裂重要的候選基因之一，但是既往關(guān)于精神分裂癥患者DRD2基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)研究結(jié)果并不一致［7－8］，可能是因為精神分裂癥是一組異質(zhì)性疾病，有研究者將精神分裂癥分成Ⅰ型和Ⅱ型研究，明顯增加了樣本的同質(zhì)性［9］。本研究將精神分裂癥分成Ⅰ型和Ⅱ型組研究，并擬采用甲基化特異性PCR和直接測序法檢測Ⅰ型、Ⅱ型精神分裂癥患者組及健康被試組DRD2的啟動子區(qū)甲基化水平并比較它們的差異，進(jìn)而或許能判斷DRD2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化是否與精神分裂發(fā)病相關(guān)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 為2008年10月至2011年12月就診于杭州第一人民醫(yī)院臨床心理科、杭州市第七人民醫(yī)院的浙江省杭州地區(qū)漢族精神分裂癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合中國精神疾病分類方案與診斷標(biāo)準(zhǔn)第 3版（The third Edition of the Chinese Classification of Mental Disorders，CCMD-3）［10］精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②陽性與陰性癥狀量表（Positive and Negative Syndrome Scale，PANSS）［11］評分≥60分；③為首次發(fā)病或因停藥復(fù)發(fā)患者；④年齡16-55歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①符合酒精依賴及其他精神活性物質(zhì)依賴的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②合并嚴(yán)重軀體疾??；③合并其他精神疾病。依據(jù)Andreasen等的陽性（Ⅰ型）、陰性（Ⅱ型）精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［12］，將研究對象劃分為Ⅰ型與Ⅱ型精神分裂癥。其中Ⅰ型組共101例患者，包括男55例，女46例。年齡16～55歲，平均（31.75±9.13）歲；病程1個月至5年，平均（18.72±13.29）月。Ⅱ型組共82例患者，包括男50例，女32例。年齡16～55歲，平均（28.61.30±7.90）歲；病程1個月至5年，平均（19.42±11.31）月。

正常對照組：100名健康被試，無精神科疾病，無精神科疾病家族史。包括男50例，女50例，均為杭州第一人民醫(yī)院保健科健康體檢者。年齡16～55歲，平均（31.19±8.46）歲。三組的年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝6.681，P＞0.05）。所有研究對象均取得知情同意書并經(jīng)過杭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)備案。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取患者和健康體檢者外周靜脈血2mL，用EDTA-K2抗凝?；蚪MDNA提取采用全血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行操作，提取后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 亞硫酸鹽處理 嚴(yán)格按照試劑盒（QIAGEN公司甲基化試劑盒）操作說明進(jìn)行血液基因組DNA亞硫酸實驗。

1.2.3 DRD2基因啟動子區(qū)甲基化特異性 PCR

（MSP） DRD2基因啟動子區(qū)基因序列來自Gen-Bank，應(yīng)用“methprimer”（http：／／www.urogene.org／methprimer／）網(wǎng)上在線設(shè)計軟件設(shè)計DRD2基因啟動子區(qū)的MSP引物，然后對其引物繼續(xù)Blast驗證其特異性。DRD2基因啟動子區(qū)基因甲基化特異性PCR引物序列：上游 5′-GAGGTTAGGATTAGAAGTTTGTGC-3′，下游 5′-AAAAAATTCCCTTCTA AATAACGAA-3′；非甲基化特異性PCR引物序列：上游 5′-GAGGTTAGGA TTAGAAGTTTGTGTG-3′，下游 5′-AAAAAATTCCCTTCTAAATAACAAA-3′。引物由上海INVITROGEN公司合成。甲基化特異性PCR和非甲基化特異性PCR設(shè)置：95℃預(yù)變性 3 min；94℃ 30 s，52℃ 20s，72℃ 20s，37個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。2％瓊脂糖凝膠電泳分析MSP擴增產(chǎn)物。DRD2基因啟動子區(qū)甲基化陽性是指用甲基化和非甲基化引物擴增均有特異性擴增產(chǎn)物，陰性是指僅有非甲基化引物擴增的產(chǎn)物。

1.2.4 直接測序 目的片段的純化回收與克隆測序：用TAKARA公司提供的DNA純化與回收試劑對PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行回收與純化。將回收產(chǎn)物克隆至PMD-19T質(zhì)粒中，抽提、純化、重組質(zhì)粒，每個樣本中挑選2個陽性克隆經(jīng)PCR法檢測正確送到上海英俊公司測序，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并且與未經(jīng)處理的序列比較，判斷是否CpG島內(nèi)位點發(fā)生甲基化，分析甲基化率（CpG島內(nèi)CpG位點甲基化和CpG島內(nèi)總CpG位點比例）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件包處理數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗和單因素方差分析進(jìn)行計數(shù)資料三樣本率的比較。若方差分析主效應(yīng)顯著，則使用post-hoc法對組間差異進(jìn)行檢測，使用LSD法。檢驗水準(zhǔn)α＝0.01，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 DRD2基因啟動子區(qū)的甲基化檢測結(jié)果 101

例Ⅰ型精神分裂癥患者、82例Ⅱ型精神分裂癥患者和100例健康被試的DRD2基因啟動子區(qū)甲基化陽性率見表1，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.579，P＞0.05），PCR 甲基化產(chǎn)物進(jìn)行回收克隆測序，對CpG位點進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)DRD2基因啟動子區(qū)有14個CpG位點，最多有8個位點甲基化，最少有0個位點甲基化。對三組被試的DRD2基因啟動子區(qū)CpG島內(nèi)位點甲基化率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)三組被試的DRD2基因啟動子區(qū)CpG島內(nèi)位點甲基化率主效應(yīng)顯著［F（2，282）＝5.522，P＜0.01］。Post-hoc檢驗發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型精神分裂癥患者DRD2基因啟動子區(qū)CpG島內(nèi)位點甲基化率高于Ⅱ型精神分裂癥患者（P＜0.01）和健康被試組（P＜0.01）差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而后兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表1）。

表1 Ⅰ型精神分裂癥組、Ⅱ型組和對照組的DRD2基因啟動子區(qū)甲基化水平比較

3 討論

本研究采用病例對照方法，對Ⅰ型和Ⅱ型精神分裂癥患者的DRD2基因CpG島的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型精神分裂癥患者DRD2基因啟動子區(qū)CpG島內(nèi)位點甲基化率顯著高于Ⅱ型精神分裂癥患者和健康被試組，而Ⅱ型精神分裂癥患者和健康被試組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究結(jié)果顯示Ⅰ型精神分裂癥DRD2基因啟動子區(qū)CpG島內(nèi)位點甲基化率明顯高于健康對照組和Ⅱ型精神分裂癥。Petronis等［6］在同卵雙生子研究中發(fā)現(xiàn)精神分裂發(fā)病差異和DRD2基因啟動子甲基化狀態(tài)相關(guān)［6］，和本研究結(jié)果一致。Zhan等［14］研究發(fā)現(xiàn)精神分裂患者中存在DRD2的表達(dá)異常，而 Popendikyte 和 Siegfried 等［15－16］的研究顯示DRD2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化對DRD2的表達(dá)起作重要的作用。這些都表明DRD2基因啟動子區(qū)CpG島內(nèi)位點甲基化和精神分裂癥密切關(guān)聯(lián)。DRD2的總效應(yīng)是激活腦的精神運動通道，這些通道的過度活躍可能是導(dǎo)致精神分裂癥的陽性癥狀，即幻覺、妄想和偏執(zhí)等［13］，Ⅰ型精神分裂癥主要表現(xiàn)主要是以幻覺妄想為主的陽性癥狀。Zhang等［7］的研究結(jié)果顯示DRD2位置特異性的胞嘧啶的甲基化率在精神分裂癥和正常對照組之間沒有明顯的差異，和本研究不一致，可能是因為本研究將精神分裂分成Ⅰ型和Ⅱ型，從而增加了樣本的同質(zhì)性。

本研究顯示Ⅱ型精神分裂癥患者DRD2基因啟動子區(qū)CpG島內(nèi)位點甲基化水平和健康對照組沒有明顯的差別。Ⅱ型精神分裂癥臨床表現(xiàn)主要以思維貧乏、情感平淡等陰性癥狀為主，而陰性癥狀主要和大腦的結(jié)構(gòu)異常有關(guān)系［17］，和神經(jīng)元的凋亡有關(guān)。Hwang等［18］研究表明精神分裂癥的陰性癥狀和DRD1基因多態(tài)性有關(guān)。

綜上所述，本研究表明DRD2基因啟動子區(qū)CpG位點甲基化可能是Ⅰ型精神分裂癥的發(fā)生的重要機制之一，為研制Ⅰ型精神分裂癥基因藥物提供新的方向。但是是什么因素導(dǎo)致Ⅰ型精神分裂癥DRD2基因啟動子區(qū)CpG位點甲基化的變化還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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