李 帥，趙巖巖，陳曉平

響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助乙醇提取蜂膠黃酮工藝優(yōu)化

李 帥，趙巖巖，陳曉平*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

對(duì)蜂膠中黃酮類(lèi)化合物提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。采用單因素試驗(yàn)分析微波時(shí)間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間、液料比6個(gè)因素對(duì)總黃酮得率影響，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，并對(duì)各個(gè)因素的顯著性和交互作用進(jìn)行分析。結(jié)果表明，最優(yōu)工藝條件為微波時(shí)間70s、微波功率282W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度77℃、浸提時(shí)間12h、液料比25∶1(mL/g)，在此條件下，蜂膠總黃酮得率為25.08%。

蜂膠；總黃酮；提?。豁憫?yīng)面分析法

蜂膠是蜜蜂從植物樹(shù)芽、花苞和樹(shù)干處采集的樹(shù)膠，并混入蜜蜂上顎腺分泌物和蜂蠟等加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物[1]。蜂膠有“黃酮化合物寶庫(kù)”之稱(chēng)，其主要活性成分包括黃酮類(lèi)、萜烯類(lèi)、有機(jī)酸、芳香醛、酯類(lèi)及多種氨基酸、酶、維生素、礦物質(zhì)等[2-4]。具有抗真菌，抗病毒和抗腫瘤特性[5]。本實(shí)驗(yàn)采用微波法對(duì)蜂膠中總黃酮進(jìn)行提取并測(cè)定提取液中總黃酮含量，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波法提取蜂膠中總黃酮的工藝條件。旨在為蜂膠黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供進(jìn)一步的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

粗蜂膠 吉林市毛氏蜜蜂養(yǎng)殖廠。

蘆丁(AR) 天津天一方科技有限公司；無(wú)水乙醇(AR) 北京化工廠；硝酸鋁 中國(guó)上海新星精細(xì)化工廠；氫氧化鈉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉 萊陽(yáng)化工實(shí)驗(yàn)廠；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；LG-10-2.4A高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；A-20組織粉碎機(jī) 金壇市科析儀器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)篩(60目) 浙江上虞市道墟儀器篩具廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

粗蜂膠置于－20℃冷凍5h，粉碎過(guò)60目篩，石油醚回流提取3h脫蠟[6-7]。

1.2.2 總黃酮提取的工藝流程

將預(yù)處理后的蜂膠進(jìn)行微波處理，微波一段時(shí)間后用乙醇浸泡一定時(shí)間，提取液離心取上清液用乙醇定容至25mL，得蜂膠黃酮樣品溶液[8-9]。

1.2.3 黃酮的測(cè)定與計(jì)算[10]

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

配制一定濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定波長(zhǎng)510nm處吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A＝0.014C＋0.0024，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9996，說(shuō)明蜂膠中總黃酮在所提取的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度和吸光度成良好的線性關(guān)系。

1.2.3.2 總黃酮含量的測(cè)定

吸取0.1mL提取液于10mL容量瓶中，按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法配制溶液，以空白試劑為參比液調(diào)零，測(cè)其吸光度記為A，測(cè)3次取平均值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得提取液質(zhì)量濃度C/(μg/mL)，按下式計(jì)算蜂膠中黃酮得率(X)。

式中：C為樣液質(zhì)量濃度/(μg/mL)；V0為定容后的體積/mL；V1為樣液體積/mL；V2為稀釋體積/mL；m為稱(chēng)取蜂膠質(zhì)量/g。

1.2.3.3 單因素試驗(yàn)

在試驗(yàn)條件：液料比20∶1(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間4h、提取溫度40℃、微波功率240W、微波時(shí)間60s不變的情況下，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，參考各因素對(duì)蜂膠總黃酮得率的影響。

1.2.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[11-13]

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波輔助乙醇提取蜂膠黃酮工藝條件。綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取微波時(shí)間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度4個(gè)因素，利用Design-Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)進(jìn)行多元回歸分析[14-15]。試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 微波輔助乙醇提取蜂膠黃酮工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and their coded levels tested in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波時(shí)間對(duì)蜂膠中總黃酮得率的影響

圖1 微波時(shí)間對(duì)蜂膠中總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of microwave treatment time on extraction rate of flavonoids

由圖1可知，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，蜂膠中總黃酮得率先增加后減少。在60s達(dá)到最大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蜂膠中總黃酮的得率逐漸減少。這可能是因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)的微波時(shí)間會(huì)導(dǎo)致蜂膠膠質(zhì)的變化。

2.1.2 微波功率對(duì)蜂膠中總黃酮得率的影響

圖2 微波功率對(duì)蜂膠中總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on extraction rate of flavonoids

由圖2可知，微波功率對(duì)得率影響較大，隨著微波功率的增加，蜂膠中總黃酮得率先增加后減少，當(dāng)微波功率達(dá)到240W時(shí)蜂膠中總黃酮得率達(dá)到最大值，隨后微波功率增加總黃酮得率開(kāi)始減少，這可能是因?yàn)樵谳^大的微波功率下部分黃酮被分解的原因。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜂膠中總黃酮得率的影響

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜂膠中總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，蜂膠總黃酮得率逐漸增加。這可能是因?yàn)殡S著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，一些醇溶性雜質(zhì)、色素等的浸出量也有所增加，從而影響了總黃酮得率。

2.1.4 乙醇提取溫度對(duì)蜂膠中總黃酮得率的影響

圖6 液料比對(duì)蜂膠中總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of solvent-to-solid on extraction rate of flavonoids

圖4 提取溫度對(duì)蜂膠中總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids

由圖4可知，隨著提取溫度的增加蜂膠總黃酮提取率逐漸增加。這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，滲透和擴(kuò)散作用加強(qiáng)，使蜂膠中總黃酮更易于溶出。

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)蜂膠中總黃酮得率的影響

圖5 乙醇提取時(shí)間對(duì)蜂膠中總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction time of on extraction rate of flavonoids

由圖5可以看出，隨著乙醇提取時(shí)間的增加，蜂膠總黃酮得率逐漸升高，這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間越長(zhǎng)蜂膠黃酮的溶出量越大。確定最佳提取時(shí)間為12h。

2.1.6 液料比對(duì)蜂膠中總黃酮得率的影響

由圖6可以看出，隨著液料比的增加，蜂膠中總黃酮得率有所增加，但增加并不明顯，再增加液料比蜂膠中總黃酮得率趨于穩(wěn)定?？梢钥闯鲆毫媳葹?5∶1時(shí)蜂膠中總黃酮已基本溶出。由于過(guò)大的液料比會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)，從浸提效果和經(jīng)濟(jì)兩方面綜合考慮，確定最佳料液比為25∶1(mL/g)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化蜂膠中總黃酮提取工藝參數(shù)

2.2.1 回歸方程的建立與分析

本試驗(yàn)共有29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中1～24號(hào)為析因試驗(yàn)，25～29號(hào)為中心試驗(yàn)，用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design-Expert 7.0軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可建立如下二次回歸方程：

表2 微波輔助乙醇提取蜂膠黃酮工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

其中二次多項(xiàng)式的相關(guān)系數(shù)R2＝95.12%、＝90.23%、＝71.87%。與值在一致性上是合理的。所以此模型能被用來(lái)指導(dǎo)設(shè)計(jì)響應(yīng)面。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis for the developed regression model

對(duì)二次回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可知，回歸模型達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，而誤差項(xiàng)不顯著，說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況吻合得較好，試驗(yàn)誤差小。因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析?；貧w系數(shù)R2＝0.9512＞0.9，表明該模型相關(guān)度好?；貧w模型各項(xiàng)的方差分析還表明，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)都有較顯著影響，所以響應(yīng)值的變化相當(dāng)復(fù)雜，各個(gè)具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是呈二次拋物面關(guān)系?；貧w模型中作用顯著項(xiàng)是X1、X2、X3、X4、X1X2、X1X3、X2X4、X12、X22、X32、X42。從各變量顯著性檢驗(yàn)P值的大小，可以看出影響蜂膠黃酮提取效果的各因素按大小排序依次為提取溫度＞微波時(shí)間＞微波功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.2 響應(yīng)面及等高線分析結(jié)果

為了考察交互項(xiàng)對(duì)蜂膠中黃酮效果的影響，在兩個(gè)因素條件固定不變的情況下，考察交互項(xiàng)對(duì)蜂膠中黃酮提取效果的影響，對(duì)模型進(jìn)行降維分析。經(jīng)響應(yīng)面7.0軟件分析，所得響應(yīng)面及其等高線見(jiàn)圖7。由圖7可知，兩因素交互作用由大到小為：微波時(shí)間和微波功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度＞微波時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波時(shí)間和提取溫度。

圖7 各兩因素交互作用對(duì)蜂膠總黃酮得率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of four process parameters on extraction rate of flavonoids

2.2.3 浸提法提取蜂膠黃酮工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證結(jié)果

為進(jìn)一步確定工藝最佳點(diǎn)，用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行數(shù)值優(yōu)化分析，以獲得最優(yōu)的浸提條件。經(jīng)分析，最適條件值分別為微波時(shí)間69.19s、微波功率282.33W、乙醇體積分?jǐn)?shù)79.87%、提取溫度77.06℃，在此條件下蜂膠中黃酮得率為25.41%?？紤]到實(shí)際工作的便利，將浸提工藝修正為微波時(shí)間70s、微波功率282W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度77℃。采用修正后的工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果測(cè)得蜂膠黃酮提取率25.08%，與模型預(yù)測(cè)值相差不大。證明該模型具有一定的可靠性。

3 結(jié) 論

采用浸提技術(shù)對(duì)蜂膠中總黃酮進(jìn)行提取，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)微波時(shí)間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度進(jìn)行方差分析。結(jié)果表明微波時(shí)間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度對(duì)蜂膠黃酮得率有顯著影響。模型擬合程度高，試驗(yàn)誤差小。

利用響應(yīng)面方法結(jié)合實(shí)際可操作性得出最佳工藝條件為微波時(shí)間70s、微波功率282W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度77℃，該條件下的蜂膠黃酮提取率為25.08%，與模型預(yù)測(cè)值25.41%相差較小，表明將響應(yīng)面設(shè)計(jì)引用到蜂膠黃酮提取工藝中可行，結(jié)果可靠。

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Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Flavonoids from Propolis by Response Surface Methodology

LI Shuai，ZHAO Yan-yan，CHEN Xiao-ping*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

This paper reports the optimization of process conditions for microwave-assisted extraction of flavonoids from propolis using response surface methodology. The effects of six operating parameters including microwave treatment time, microwave power, solvent composition (ethanol concentration), temperature, time and solvent-to-solid on total flavonoid yield were investigated through one-factor-at-a-time experiments. The significance and interaction effects of microwave treatment time, microwave power, ethanol concentration and temperature were analyzed by response surface analysis based on a threelevel central composite design. The optimal microwave-assisted extraction conditions for total flavonoids were determined as follows∶ 70 s microwave treatment at 282 W followed by extraction with 80% ethanol aqueous solution at a solvent-to-solid of 25 mL/g and 77 ℃ for 12 h. Under these conditions, the yield of total flavonoids from propolis was up to 25.08%.

propolis；flavonoids；extraction；response surface methodology

TS201.2

A

1002-6630(2012)18-0127-06

2011-07-16

李帥(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)與功能食品。E-mail：huajiyuji1986@163.com

*通信作者：陳曉平(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)與功能食品。E-mail：XP63@Tom.com