高寧，王強，王振月，程玉鵬，3＊

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300192；3.哈爾濱師范大學，哈爾濱 150024）

柴胡為傘形科植物柴胡（BupleurumchinenseDC.）或 狹 葉 柴 胡 （BupleurumscorzonerifoliumWilld.）的干燥根，是我國傳統的重要中藥材［1］。柴胡中含有皂苷、甾醇、黃酮、揮發(fā)油、多糖等成分，主要藥效成分為柴胡皂苷，其中柴胡皂苷a，d具有明顯的藥理活性。柴胡的藥理作用廣泛，具有鎮(zhèn)靜、解熱、抗炎、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤及調節(jié)免疫系統活性等作用，極具開發(fā)與研究前景［2－3］。但近幾年，由于對柴胡野生藥用資源的盲目、過度采挖，致使柴胡的藥用資源日益減少，已不能滿足市場的需要。內生真菌（endophytic fungi）是一類普遍存在于健康植物體內的，不引起宿主病變的共生菌。研究表明，某些內生真菌能夠產生與宿主相同或相似的化學成分，特別是近年來，相繼發(fā)現了能夠產紫杉醇、長春花堿等有效成分的內生真菌，使得藥用植物內生真菌這一研究領域受到了廣泛的關注［4］。由于柴胡資源日益緊張，因此，對柴胡開展內生真菌研究，明確柴胡內生真菌分布特征，將有助于進一步開發(fā)能夠產生有效成分的柴胡內生真菌、篩選并減少對野生柴胡的依賴，降低經濟與生態(tài)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

原植物采自黑龍江中醫(yī)藥大學藥用植物園，經黑龍江中醫(yī)藥大學王振月教授鑒定為狹葉柴胡（BupleurumscorzonerifoliumWilld.）。

試劑：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水1000m L，瓊脂15g。121℃高壓蒸汽滅菌30min），乳酸－棉蘭染液，升汞，醫(yī)用酒精等。

儀器：電熱手提式壓力蒸汽消毒器（哈爾濱市松花江醫(yī)療器械廠）、Ⅱ級B2型生物安全柜（北京哈爾東聯儀器制造有限公司）、PH－71電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、奧林巴斯CX31顯微鏡（奧林巴斯（中國）有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 柴胡內生真菌的分離

取新鮮健康的狹葉柴胡植株，用洗潔劑清洗材料表面，蒸餾水沖洗干凈，除去泥土大顆粒及表面浮灰。表面消毒：無菌條件下將實驗材料放入75%乙醇中浸泡45s，無菌水沖洗4～5次（每次2min），隨后放入0.1%升汞溶液中浸泡3min，無菌水沖洗4～5次（每次2min）。用無菌刀片將根切成5mm×5mm×5mm的小塊，將莖切成5mm的小段，將葉切成5mm×5mm的小片。將切好的材料放入PDA培養(yǎng)基中，每個平皿中放置4～5塊，并盡量將切面貼于培養(yǎng)基。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置，暗培養(yǎng)5～10天，每日定時觀察材料，待材料切口處長出菌絲后，及時地挑取前端的菌絲，將其轉接至新的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用菌絲頂端純化法逐步純化柴胡內生真菌。將純化的菌種編號，轉入PDA斜面，置于4℃冰箱中保存［5］。

1.2.2 狹葉柴胡內生真菌的鑒定

采用點植法觀察柴胡內生真菌的菌落形態(tài)，利用插片法觀察柴胡內生真菌顯微結構特征，參照文獻［6－7］進行柴胡內生真菌的鑒定。

2 結果與分析

2.1 狹葉柴胡內生真菌鑒定結果

從狹葉柴胡中共分離得到13株內生真菌，其中根中分離得到7株，葉中分離的到2株，莖中分離得到4株。經形態(tài)學觀察與顯微鑒定，除一株毛霉屬真菌為接合菌亞門外，其余分屬于半知菌類的2目、3科、6屬。狹葉柴胡內生真菌各屬具體分布見表1。

表1 狹葉柴胡內生真菌的分布特征

2.2 柴胡內生真菌分布特征

已鑒定的13株柴胡內生真菌分屬于7個不同的屬，于柴胡的根、莖、葉中都可分離到內生真菌，表明狹葉柴胡內生真菌具有一定的多樣性且內生真菌在狹葉柴胡各組織均有分布。但各組織中所分離得到的內生真菌數量差距較大，其中根中分離得到7株，明顯高于莖（4株）與葉（2株）中分離的內生真菌數量。所分離出的內生真菌以半知菌為主，分離出的內生真菌中，并沒有優(yōu)勢單一的菌群，且未見某一種屬在根、莖、葉均能夠有分布。特別是曲霉屬、毛霉屬僅在根中分離得到，而鐮刀孢屬真菌僅在莖中分離得到，表明狹葉柴胡內生真菌的分布具有一定的組織專一性。

3 結論與討論

以往研究結果顯示，不同植物中分離得到的內生真菌數量與種類均存在差異［8］，本研究共從狹葉柴胡中分離得到13株內生真菌，分屬于7個不同屬，且各屬真菌分布并不均一，表明狹葉柴胡內生真菌具有一定的生物多樣性，且分布具有一定的組織專一性。

研究過程中發(fā)現，狹葉柴胡組織塊表面消毒的方法直接影響內生真菌的分離效果，研究之初，本項目組采用已有的表面消毒方法，然而效果并不理想，由于各植物表面結構及組織本身特點存在差異，使得表面消毒劑的種類及消毒時間需酌情而定，一些方法雖然能夠適用于幾種植物與組織，但尚未有一種能夠普遍適用的表面消毒程序，因此，在開始分離某一植物內生真菌時，要對所用消毒劑的種類、聯合使用的組合方式及消毒時間等進行系統的考察，使其能夠在不傷及內生真菌的前提下殺滅植物表面真菌。

內生真菌分離過程中另一個重要問題是內生細菌的影響。植物內生菌大體可分為內生真菌與內生細菌，與內生真菌相似，內生細菌同樣廣泛的存在于各種屬植物中，且其生長迅速，一般1～2天即可從組織切面處長出，影響了后續(xù)內生真菌的分離與純化。因此，本實驗在真菌純化過程中向培養(yǎng)基中添加一定濃度的抗生素從而抑制內生細菌的生長，排除干擾。另外，在內生真菌分離過程中，要注意每日觀察，及時挑取從切面處長出的內生真菌，同時要挑取菌絲生長的最前端部分，特別是同一切面同時長出2種以上內生真菌時，要注意防止交叉污染。

由于內生真菌能夠產生與宿主相同或相似的有效成分，且真菌具有易培養(yǎng)、易控制、生產成本低、生長快等特點，使得這一研究領域受到科學工作者的廣泛關注，本研究對柴胡內生真菌進行了分離并探討了柴胡內生真菌的分布特征，有關能夠產生有效成分的狹葉柴胡內生真菌的篩選與開發(fā)利用將在進一步的研究工作中開展。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.一部.2010版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：263.

［2］吳明芳.中藥柴胡中的有效成分及其藥理作用的研究進展［J］.中華中西醫(yī)學雜志，2010，8（6）：32－34.

［3］張陽，李敏，柳林，等.柴胡生長發(fā)育規(guī)律的分析［J］.中國林副特產，2010（5）：45－46.

［4］胡鳳，程玉鵬，王振月，等.藥用植物內生真菌研究現狀及其應用前景［J］.生物技術通訊，2008，19（5）：781－783.

［5］程玉鵬，王振月，李慧玲，等.盤龍參內生真菌分布特征的研究［J］.中國林副特產，2008（2）：22－23.

［6］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上?？茖W技術出版社，1979.

［7］H.L.巴尼特，B.B.亨特.沈崇堯，譯.半知菌屬圖解［M］.北京：科學出版社，1977.

［8］姜怡，楊穎，陳華紅，等.植物內生菌資源［J］.微生物學通報，2005，32（6）：146－147.