劉燕燕，楊 璇，韓 松，蘇吉兒，羅 宏，李俊發(fā)

（首都醫(yī)科大學神經(jīng)生物學系北京神經(jīng)科學研究所，北京 100069）

cPKCγ參與低氧預適應對小鼠腦缺血皮質內CRMP2水解和磷酸化的調節(jié)

劉燕燕，楊 璇，韓 松，蘇吉兒，羅 宏，李俊發(fā)*

（首都醫(yī)科大學神經(jīng)生物學系北京神經(jīng)科學研究所，北京 100069）

目的 探討經(jīng)典型蛋白激酶Cγ（cPKCγ）在低氧預適應（HPC）調節(jié)小鼠腦缺血皮質內腦衰反應蛋白-2（CRMP2）水解和磷酸化中作用。方法 利用雄性BALB/c小鼠（18～22 g）HPC和大腦中動脈阻塞（MCAO）模型，借助蛋白印跡、免疫共沉淀和免疫組化等生物化學技術，觀察cPKCγ激活對小鼠缺血腦皮質內CRMP2蛋白水解程度（BDP）和磷酸化水平（p-CRMP2）、cPKCγ-CRMP2相互作用和皮質缺血半影區(qū)內p-CRMP2陽性細胞數(shù)的影響。結果HPC顯著提高缺血腦皮質半影區(qū)內p-CRMP2水平，降低BDP產(chǎn)物形成（P＜0.05），而側腦室注射cPKCγ抑制劑Go6983（6nmol/L）可明顯解除HPC對半影區(qū)內CRMP2蛋白水解和磷酸化的調節(jié)作用（P＜0.05）;免疫共沉淀結果提示，cPKCγ激活程度參與HPC對缺血腦皮質半影區(qū)內cPKCγ-CRMP2相互作用的調節(jié);同時，cPKCγ激活與HPC提高腦缺血半影區(qū)內p-CRMP2陽性細胞數(shù)有關（P＜0.05）。結論cPKCγ參與HPC對小鼠缺血腦皮質內CRMP2水解與磷酸化的調節(jié)。

缺血/低氧預適應;大腦中動脈阻塞;經(jīng)典型蛋白激酶C;腦衰反應蛋白-2

*通信作者（corresponding author）:junfali@ccmu.edu.cn

腦卒中給人類健康和生命造成極大威脅，給患者帶來極大痛苦，給家庭及社會造成沉重負擔。因此，提高腦中風的治療與預防水平、降低腦中風的發(fā)病率，和死亡率顯得尤為重要。腦低氧預適應（hypoxic preconditioning，HPC）是一種內源性保護機制，能提高組織器官對缺血/低氧的耐受，對其機制及參與細胞信號傳導通路的研究，對臨床治療腦缺血/低氧損傷具有重要指導意義。腦衰反應調節(jié)蛋白2（CRMP2）是最早被發(fā)現(xiàn)的CRMPs家族成員，被認為是semaphorin3A介導的生長錐塌陷信號通路中關鍵細胞內信號蛋白［1］。本實驗室發(fā)現(xiàn)腦HPC后經(jīng)典型蛋白激酶Cγ（cPKCγ）的激活水平增加，借助蛋白質組學技術曾發(fā)現(xiàn)HPC后cPKCγ-CRMP2相互作用明顯增強［2］;側腦室注射 TAT-CRMP2可減少 CRMP2水解同時提高p-CRMP2水平，并在一定程度上減輕腦缺血損傷［3］。據(jù)此，本實驗擬利用小鼠HPC和腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）腦缺血模型，探討cPKCγ對腦HPC對小鼠缺血腦皮質內CRMP2水解和磷酸化的調節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級 BALB/c小鼠［雄性，18～22 g，8～10周，首都醫(yī)科大學動物部，許可證編號:SCXK-（軍）2007-004］;兔源性 cPKCγ、CRMP2 抗體（一抗，Santa Cruze公司）和p-CRMP2抗體（Abcam公司）;鼠源性β-actin單克隆抗體（Sigma公司）;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體和山羊抗鼠抗體（二抗）和ECL反應底物（Chemicon公司）和Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司）;BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司）;Kodak BioMaxMR X-光片（Kodak公司）;蛋白酶抑制劑（AEBSF，Leupeptin，Aprotinin，Pepstatin A和Chymostrypsin）、磷酸酶抑制劑（KF，Okadaic acid，Sodium pyrophosphate 和 Sodium orthovanadate）、Sodium deoxycholate、DTT、NP-40、EDTA、EGTA和SDS等試劑（Sigma公司）;小鼠線栓（頭端直徑為0.23 mm，沙東生物技術有限公司）。

1.2 實驗動物和模型制備

按本室已建方法制備小鼠 HPC模型［4］。在HPC后1 h，行小鼠MCAO腦缺血模型制備以及側腦室注射［5］。簡述如下:腹腔注射戊巴比妥鈉（0.6 g/kg）麻醉小鼠，顯微鏡下游離左側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，結扎頸總動脈的近心端和頸外動脈的遠心端;將頭端直徑0.23 mm、主干直徑0.18 mm的栓塞線，由頸外動脈插入至大腦中動脈 （深度約12.0 mm），并固定線栓。假手術組只進行手術操作，不插入線栓。整個手術過程平均20 min完成，此間保持小鼠體溫，術后放入有清潔墊料的飼養(yǎng)盒中，自由飲水、進食。小鼠在麻醉后固定小鼠于腦立體定位儀上，局部用利多卡因局麻后行正中切口。按側腦室的體表投影，以前囟為零點，在前囟后2.0 mm，左側1.0 mm和3.5 mm深度用微量注射器將5 μL cPKCγ抑制劑 Go6983（6 nmol/L）或滅菌二甲基雙砜 （DMSO）分別緩慢地注入到小鼠左側腦室。將動物分為常氧假手術（sham）、缺血 （I）、低氧預適應 （HPC）+I、HPC 1 h后側腦室注射Go6983或DMSO后再行缺血五組。小鼠飼養(yǎng)條件為22±2℃、相對濕度55% ±3%，自由進食進水，手術前12 h禁食。

1.3 免疫沉淀

選取小鼠皮質層組織不同蛋白組分，進行操作如下:首先取蛋白質 G-Agarose 30 μL進行預洗，加入IP緩沖液500 μL，輕輕搖洗，4℃ 12 000×g離心40 s后，棄上清，重復3次;然后，取總蛋白500 μg，蛋白質 G-Agarose 30 μL，加 IP 緩沖液至500 μL，于脫色搖床4℃孵育1 h;4℃ 12 000×g離心40 s后，保留上清 （以排除與蛋白質G-Agarose非特異性結合蛋白）。上清內加入相應抗體1～5 μg和蛋白質G-Agarose 30 μL，室溫下脫色搖床上孵育過夜。4℃ 12 000×g離心40 s后，棄上清，在沉淀中加入 IP緩沖液500 μL輕輕搖洗，4℃12 000×g離心40 s后，棄上清，重復3次。最后，在沉淀中加入100 mmol/L甘氨酸 （pH=3.0）100 μL，輕 輕 震 蕩，90℃ 加 熱 變 性 5 min，12 000×g離心40 s，吸取上清，用1.5 mol/L Tris-Cl（pH=8.8）緩沖液調節(jié)上清液的pH至中性;或在沉淀中加入100 μL thiourea緩沖液，振蕩5 min，離心取上清保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組織化學（DAB法）

將小鼠用1%戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，沿胸旁正中線切開皮膚、剪斷肋骨、暴露心臟。在心尖處剪開左心室，插入灌流導管至升主動脈，剪開右心耳。先用0.9%NaCl溶液灌流，每只小鼠約20 mL;血液沖凈后用4%多聚甲醛固定液灌流，每只小鼠100 mL，持續(xù)30 min。取腦，放入4%多聚甲醛固定液中后固定4～6 h，再放入20%的蔗糖溶液中脫水后，冰凍切片機中切片。DAB顯色，鏡下觀察染色結果。

1.5 免疫組化p-CRMP-2陽性細胞計數(shù)方法

在高倍視野下對小鼠大腦皮質組織內染色完整細胞進行計數(shù)。每只動物選取5張腦片，每張腦片選取8個高倍視野，取平均值。計算出每高倍視野中染色完整細胞的細胞數(shù)。實驗數(shù)據(jù)用SPSS for Windows11.5統(tǒng)計軟件進行單因素發(fā)差分析，結果以均數(shù)±標準差（±s）表示。

1.6 統(tǒng)計學分析

Western Blot結果應用Quantity One分析軟件進行半定量分析。所有實驗數(shù)據(jù)均通過獨立樣本t檢驗和單因素方差分析進行統(tǒng)計學檢驗，以均數(shù)±標準差（±s）表示。

2 結果

2.1 cPKCγ參與了HPC對缺血皮質半影區(qū)內CRMP2水解及磷酸化的調節(jié)

MCAO 6 h后，各實驗組CRMP2的總蛋白量未發(fā)現(xiàn)明顯變化;I組小鼠的腦皮質半影區(qū)內CRMP2磷酸化水平下降，并且出現(xiàn)了大量剪切片段;HPC處理組腦缺血皮質半影區(qū)CRMP2剪切片段減少，磷酸化水平增高;應用Go6983（6nmol/L）則一定程度上了削弱了HPC對CRMP2磷酸化以及剪切片段的影響（圖1）。

2.2 cPKCγ活性對cPKCγ-CRMP2相互作用影響

cPKCγ與CRMP2之間存在相互作用，缺血后二者相互作用減弱，而HPC一定程度上可能減輕缺血對二者相互作用影響;應用Go6983后，HPC對缺血所致cPKCγ與CRMP2之間相互作用的影響可能被部分消除，提示cPKCγ與CRMP2之間相互作用可能與cPKCγ激活水平有關（圖2）。

2.3 HPC和cPKCγ抑制劑Go6983（6 nmol/L）對小鼠腦缺血皮質半影區(qū)內p-CRMP2陽性細胞數(shù)的影響

HPC可減輕因腦缺血所致的p-CRMP2陽性細胞數(shù)目減少;應用Go6983則可取消HPC對腦缺血皮質半影區(qū)p-CRMP2陽性細胞的影響（圖3）。

3 討論

HPC是一種內源性保護現(xiàn)象，人們發(fā)現(xiàn)PKCs的激活是預適應形成的關鍵因素［6］。cPKCγ是神經(jīng)組織特有的蛋白激酶C家族成員，以往研究報道HPC能緩解缺血刺激引起的cPKCγ激活水平下降［7］。cPKCγ的激活在缺血中的作用在國際上是存在爭議的，本實驗既往研究結果證明cPKCγ的膜轉位水平升高可能參與了HPC對腦缺血的腦保護作用，這可能是因為彼此之間研究的缺血時間點不同有關。

借助蛋白質組學技術發(fā)現(xiàn)，HPC后cPKCγ與CRMP2相互作用明顯增加。CRMP2是最早發(fā)現(xiàn)的CRMPs家族成員，在成熟腦組織中的表達量最高，可以與多種蛋白發(fā)生相互作用［8－10］，并可能參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。有報道CRMP2是Rho、CDK5和GSK3的底物，并參與了生長錐的塌陷，軸突生長，缺血和阿爾茨海默病等［11－12］。然而，對于CRMP2的正常生理和病理功能還不清楚。研究表明，腦內CRMP2可與神經(jīng)纖維瘤蛋白存在相互作用，提示其可能在神經(jīng)元的發(fā)生過程中起作用［13］。有多個研究小組初步探討了CRMP2在腦缺血，神經(jīng)毒性和外傷創(chuàng)傷中的變化。利用雙向電泳技術分析了大腦中動脈阻塞24 h后缺血皮質內蛋白質組學的變化情況，發(fā)現(xiàn)CRMP2表達明顯升高［14］。在神經(jīng)毒素和創(chuàng)傷腦損傷過程中，CRMP2可被calpain-2所降解［15］，其降解片段（BDP）隨著損傷或處理時間的延長而增加。檢測新生鼠腦經(jīng)低氧-缺血（HI）處理后CRMP2的變化，發(fā)現(xiàn)HI可導致CRMP2的低磷酸化狀態(tài)，其低磷酸化可能是由于上游的激酶CDK5被抑制所致［16］。利用缺血再灌注模型研究發(fā)現(xiàn)Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）增加，p-CRMP2水平增加，可能介導腦缺血軸突的損傷作用［17］。本實驗室既往研究發(fā)現(xiàn)小鼠腦缺血損傷6 h后CRMP2水解片段增加，磷酸化水平降低。本實驗通過Western blot技術檢測發(fā)現(xiàn)HPC可顯著提高缺血腦皮質半影區(qū)內p-CRMP2水平，降低BDP產(chǎn)物形成，而側腦室注射 cPKCγ抑制劑 Go6983（6 nmol/L）可明顯解除HPC對半影區(qū)內CRMP2蛋白水解和磷酸化的調節(jié)作用;免疫共沉淀結果表明cPKCγ激活程度參與HPC對缺血腦皮層半影區(qū)內cPKCγ-CRMP2相互作用的調節(jié);同時，免疫組化進一步證實，cPKCγ激活與HPC提高腦缺血半影區(qū)內p-CRMP2陽性細胞數(shù)有關。

圖1 cPKCγ參與HPC對缺血腦皮質半影區(qū)內CRMP2磷酸化和水解的調節(jié)Fig 1 cPKCγ involved in the regulation of hypoxic preconditioning on CRMP2 hydrolysis and phosphorylation in cerebral ischemic mice

圖2 小鼠腦皮質半影區(qū)cPKCγ活性對CRMP2-cPKCγ相互作用影響Fig 2 The activity of cPKCγ affect the interaction between cPKCγ and CRMP2 in the peri-infarct region of cerebral ischemic mice

圖3 HPC和cPKCγ抑制劑Go6983（6 nmol/L）對MCAO所致小鼠腦皮質半影區(qū)內p-CRMP2陽性細胞數(shù)的影響Fig 3 Effects of HPC and cPKCγ inhibitor Go6983（6 nmol/L）on the MCAO-induced p-CRMP2 positive cells loss in peri-infarct area of mice

本實驗研究提示，cPKCγ參與低氧預適應對小鼠腦缺血皮層內CRMP2水解和磷酸化的調節(jié)，這種作用很可能是cPKCγ通過增加CRMP2磷酸化，減輕其水解來介導的。但是，cPKCγ是否可直接磷酸化CRMP2，cPKCγ-CRMP2信號通路在腦缺血/低氧性損傷和適應中的作用如何都有待進一步探討。

［1］Uchida Y，Ohshima T，Yamashita N，et al.Semaphorin3A signaling mediated by Fyn-dependent tyrosine phosphorylation of collapsin response mediator protein 2 at tyrosine 32［J］.J Biol Chem，2009，284:27393－27401.

［2］Zhang N，Yin YL，Han S，et al.Hypoxic preconditioning induced neuroprotection against cerebral ischemic injuries and its cPKCgamma-mediated molecular mechanism ［J］.Neurochem Int，2011，58:684 －692.

［3］Bu XN，Zhang N，Yang X，et al.Proteomic analysis of cPKCbetaII-interacting proteins involved in HPC-induced neuroprotection against cerebral ischemia of mice［J］.J Neurochem，2011，117:346－356.

［4］Li JF，Niu CC，Han S，et al.Identification of protein kinase C isoforms involved in cerebral hypoxic preconditioning of mice［J］.Brain Res，2005，1060:62 －72.

［5］Ma J，Zhao L，Nowak TS，et al.Selective，reversible occlusion of the middle cerebral artery in rats by an intraluminal approach.Optimized filament design and methodology［J］.J Neurosci Methods，2006，156:76 －83.

［6］Marber MS，Ischemic preconditioning in isolated cells［J］.Circ Res，2000，86:926 －931.

［7］Katsura KI，Kurihara J，Kato H，et al.Ischemic pre-conditioning affects the subcellular distribution of protein kinase C and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in the gerbil hippocampal CA1 neurons ［J］.Neurol Res，2001，23:751－754.

［8］Brittain JM，Piekarz AD，Yuying Wang，et al.An atypical role for collapsin response mediator protein 2（CRMP-2）in neurotransmitter release via interaction with presynaptic voltage-gated calcium channels［J］.J Biol Chem，2009，284:31375－31390.

［9］Hensley K，Christov A，Kamat S，et al.Proteomic identification of binding partners for the brain metabolite lanthionine ketimine（LK）and documentation of LK effects on microglia and motoneuron cell cultures ［J］.J Neurosci，2010，30:2979－2988.

［10］Patrakitkomjorn S，Kobayashi D，Morikawa T，et al.Neurofibromatosis type 1（NF1）tumor suppressor，neurofibromin，regulates the neuronal differentiation of PC12 cells via its associating protein，CRMP-2［J］.J Biol Chem，2008，283:9399－9413.

［11］Bretin S，Rogemond V，Marin P，et al.Calpain product of WT-CRMP2 reduces the amount of surface NR2B NMDA receptor subunit［J］.J Neurochem，2006，98:1252－1265.

［12］Arimura N，Menager C，Kawano Y，et al.Phosphorylation by Rho kinase regulates CRMP-2 activity in growth cones［J］.Mol Cell Biol，2005，25:9973 －9984.

［13］ Lin YL and Hsueh YP，Neurofibromin interacts with CRMP-2 and CRMP-4 in rat brain，Biochem.Biophys［J］.Res Commun，2008，369:747－752.

［14］Chen A，Liao W P，Lu Q，et al.Upregulation of dihydropyrimidinase-related protein 2，spectrin alpha II chain，heat shock cognate protein 70 pseudogene 1 and tropomodulin 2 after focal cerebral ischemia in rats——a proteomics approach［J］.Neurochem Int，2007，50:1078 －1086.

［15］Zhang Z，Ottens AK，Sadasivan S，et al.Calpain-mediated collapsin response mediator protein-1，-2，and-4 proteolysis after neurotoxic and traumatic brain injury［J］.J Neurotrauma，2007，24:460－472.

［16］Zhou Y，Bhatia I，Cai Z，et al.Proteomic analysis of neonatal mouse brain:evidence for hypoxia-and ischemia-induced dephosphorylation of collapsin response mediator proteins［J］.J Proteome Res，2008，7:2507 －2515.

［17］Hou ST，Jiang SX，Aylsworth A，et al.CaMKII phosphorylates collapsin response mediator protein 2 and modulates axonal damage during glutamate excitotoxicity［J］.J Neurochem，2009，111:870－881.

cPKCγ is involved in the regulation of hypoxic preconditioning on CRMP2 hydrolysis and phosphorylation in ischemic cortex of mice

LIU Yan-yan，YANG Xuan，HAN Song，SU Ji-er，LUO Hong，LI Jun-fa*

（Dep.of Neurobiology and Beijing Institute for Neuroscience，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

ObjectiveTo explore the role of cPKCγ in hypoxic preconditioning（HPC）regulating hydrolysis and phosphorylation of collapsin response mediated protein 2（CRMP2）in the ischemic cortex of mice.MethodsUsing our established HPC and middle cerebral artery occlusion（MCAO）BALB/c mouse models（male，18 ～22 g），We applied Western blot，immunoprecipitation（IP）and immunohistochemisty to determine the effect of cPKCγ activation on CRMP2 hydrolysis and phosphorylation，cPKCγ-CRMP2 interaction and p-CRMP2 positive cells'number in the peri-infarct region of MCAO mice.ResultsHPC inhibited the decrease of p-CRMP2 level and the increase of BDP in peri-infarct region of ischemic cortex.Pretreatment of cPKCγ inhibitor Go6983（6nmol/L）could depress the HPC-induced inhibitory effect on CRMP2 dephosphorylation and hydrolysis in peri-infarct area of ischemic cortex;IP results showed that the activity of cPKCγ could affect the interaction between cPKCγ and CRMP2;in addition，the immunohistochemistry results also demonstrated the same effect of cPKCγ on p-CRMP2 positive cells in peri-infarct region of ischemic cortex.ConclusionscPKCγ is involved in the regulation of HPC on CRMP2 phosphorylation and hydrolysis in ischemic cortex of MCAO mice.

HPC;middle cerebral artery occlusion;cPKCγ;CRMP2

R339.5

A

1001-6325（2012）01-0025-06

2011－10－09

2011－11－23

國家自然科學基金（30871219，31071048，31171147）;973計劃前期專項（2011CB512109）;教育部高等學校博士點科研基金（20091107110001）;北京市屬高等學校人才強教深化計劃創(chuàng)新人才資助（PHR 200906116）