孫 鵬 戴 麗 胡瑞陽(yáng) 習(xí) 洋 李允菲 袁存權(quán) 孫 妍 李 云

(林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083)

刺槐(Robinia pseudoacacia)屬于雌雄同花植物，原生于北美洲，后被廣泛引種到歐洲、亞洲等地。刺槐葉片含有大量粗蛋白，可作飼料。刺槐木質(zhì)堅(jiān)硬且具有發(fā)達(dá)的根系。刺槐根部有根瘤，有提高地力之效;刺槐具有很強(qiáng)的抗旱能力，能夠適應(yīng)石質(zhì)山地的干旱環(huán)境。刺槐的花屬于蝶形花，開花時(shí)香氣四溢，并且可供食用［1］。此外，刺槐還是一種重要的蜜源植物。綜上所述，刺槐具有很好的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但刺槐的應(yīng)用還存在一些亟待解決的問(wèn)題，例如，有些刺槐無(wú)性系速生性好，但抗性差;有些抗性強(qiáng)，但干型差或生長(zhǎng)慢;有些葉片粗蛋白含量高，但生物量低等［2］。目前，刺槐改良以選種為主，但其選種是建立在實(shí)生刺槐林自由授粉的基礎(chǔ)上，變異程度低，選擇偶然性大，人為控制能力差。如果能夠采用控制授粉實(shí)現(xiàn)刺槐雜交育種，必將提高刺槐改良程度。然而，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)多年研究發(fā)現(xiàn)刺槐雜交時(shí)去雄操作技術(shù)要求高、難度大，雜交結(jié)實(shí)率非常低，特別是去雄和套袋操作對(duì)刺槐的授粉受精和坐果影響嚴(yán)重。Dini－papanastasi et al.［3］對(duì)刺槐雜交育種的報(bào)道也發(fā)現(xiàn)雜交結(jié)實(shí)率低的現(xiàn)象。雜交工作在開花期進(jìn)行，包括去雄、套袋、授粉等對(duì)花展開的操作。另外，雜交的成功還有賴于外源花粉的親和能力。鑒于此，詳細(xì)了解刺槐的開花傳粉及交配方式對(duì)于提高刺槐的雜交育種工作水平具有重要的意義。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)刺槐開花特性的研究還比較少，主要有郝晨等［4］和姜金仲等［5］對(duì)四倍體刺槐花器官變異的報(bào)道，而二倍體刺槐的有關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究關(guān)于刺槐花部外形、花粉萌發(fā)、柱頭可授性的研究對(duì)于雜交時(shí)去雄時(shí)機(jī)的選擇，花粉采集時(shí)間和儲(chǔ)存方式以及授粉時(shí)機(jī)的選擇具有指導(dǎo)意義。此外，關(guān)于刺槐天然群體的交配方式目前看法仍不一致，Surles et al.［6］利用等位酶技術(shù)研究認(rèn)為刺槐天然群體異交率高達(dá)80%以上，而原法憲［7］認(rèn)為刺槐是高度自交的樹種。另外，Lian et al［8］從9個(gè)刺槐無(wú)性系采集種子，發(fā)現(xiàn)這些種子是高度自交的。針對(duì)上述疑問(wèn)，本研究從刺槐的開花特性和傳粉生物學(xué)入手，以延慶實(shí)生刺槐林為試材，以期闡明刺槐天然狀態(tài)下自交及異交的親和能力。該研究結(jié)果將有助于刺槐雜交時(shí)親本的選擇，以及提高刺槐雜交結(jié)實(shí)率。

1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)地選在北京市延慶縣米家堡苗圃(N40°29.748＇～ 40°30.276＇，E115°59.192＇～ 115°59.883＇)，延慶位于北京城區(qū)西北70 km處，屬大陸性季風(fēng)氣候，處于溫帶與中溫帶、半干旱與半濕潤(rùn)帶的過(guò)渡地帶。氣候冬冷夏涼，年平均氣溫8℃，刺槐多在5月底6月初開花。延慶米家堡苗圃的刺槐林為人工刺槐實(shí)生林。林區(qū)面積約6 hm2。所選樣樹高6～7 m，地徑12～15 cm，胸徑8～10 cm，為開花結(jié)實(shí)盛期的成年植株。

2 材料與方法

開花生物學(xué)特性觀察:選擇生長(zhǎng)正常、樹體健壯的3株刺槐成年植株，于開花后1 d在選定的每株樹上隨機(jī)選取3個(gè)正?；ㄐ?，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量花序長(zhǎng)和花序直徑，然后在每個(gè)花序上選擇10朵花，測(cè)量小花長(zhǎng)、小花直徑、花柱長(zhǎng)、柱頭與花藥的最長(zhǎng)和最短距離。

花粉形態(tài)觀察:采集開花前2 d、開花當(dāng)天、開花后24 h、開花后48 h及開花后72 h的花，用FAA固定。然后經(jīng)叔丁醇干燥，鍍金，利用掃描電子顯微鏡觀察花粉形態(tài)并照相。

花粉體外萌發(fā)試驗(yàn):開花當(dāng)天采集花粉，放在培養(yǎng)皿中，加硅膠使其干燥，并于常溫保存。用TTC法［9］測(cè)定花粉保存 24、48、72 h 后的活力。

花粉體內(nèi)萌發(fā)試驗(yàn):首先在開花散粉前人工去雄套袋，然后在適授期授粉，于授粉后2、6、10、24、48 h采集花朵，用FAA固定，根據(jù)胡適宜［10］報(bào)道的方法染色壓片后在熒光顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)情況。本試驗(yàn)材料取自3棵生長(zhǎng)狀況良好的單株，每個(gè)單株設(shè)3次重復(fù)。

柱頭可授性試驗(yàn):于幼花期、將開花期(該時(shí)期為本文叫法，特指開花前1～2 d的時(shí)期，圖1A，下同)、開花當(dāng)天、開花后24 h、開花后48 h，以及開花后 72 h 采集花朵，參照 Suwan et al.［11］的方法，利用掃描電子顯微鏡觀察柱頭形態(tài)，判斷其可授性。試驗(yàn)材料取自3棵生長(zhǎng)狀況良好的單株，每個(gè)單株設(shè)3次重復(fù)。

傳粉方式檢測(cè):在盛花期選取3株間隔50 m的刺槐單株觀察其傳粉媒介。在每個(gè)單株4周8個(gè)方位布置涂布凡士林的載玻片各2枚，凡士林涂布面積為2.5 cm×5.0 cm，露置1 d后收回，鏡檢以風(fēng)為媒介散布花粉的數(shù)量。刺槐花粉的鑒定以其花粉的大小和形狀與單獨(dú)采制的標(biāo)準(zhǔn)花粉對(duì)比計(jì)數(shù)。

在野外選擇間隔50 m以上的3株生長(zhǎng)狀況良好的刺槐單株，每個(gè)單株選擇10個(gè)花序，于開花后連續(xù)3 d，每天分6個(gè)時(shí)段:8:00—8:30、10:00—10:30、12:00— 12:30、14:00—14:30、16:00—16:30、18:00—18:30進(jìn)行觀察，分別記為時(shí)段1至?xí)r段6。同時(shí)，對(duì)刺槐植株上的訪花昆蟲進(jìn)行觀察并拍照，凡發(fā)現(xiàn)有昆蟲訪花并在花上停留者，就用乙烯瓶捕捉、殺死并鑒定。同時(shí)記錄每植株上所有來(lái)訪昆蟲的訪花次數(shù)，并計(jì)算訪花頻率，訪花頻率的計(jì)量方法為10個(gè)花序在30 min內(nèi)被訪問(wèn)的次數(shù)。

雜交指數(shù)估算:按照李昆等［12］研究小桐子的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行花序直徑、花朵大小和開花行為的測(cè)量及交配系統(tǒng)的評(píng)判。具體方法:花朵直徑(D)D＜1 mm記為0，1 mm≤D＜2 mm 記為1，2 mm≤D＜6 mm 記為2，D＞6 mm記為3;花藥開裂時(shí)間與柱頭可授期之間的時(shí)間間隔，同時(shí)或雌蕊先熟記為0，雄蕊先熟記為1;柱頭與花藥的空間位置，同一高度記為0，空間分離記為1。

上述三者之和為OC，I值。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為:OC，I為 0時(shí)，交配系統(tǒng)為閉花受精;OC，I=1時(shí)，交配系統(tǒng)為專性自交;OC，I為 2 時(shí)，交配系統(tǒng)為兼性自交;OC，I為 3時(shí)，交配系統(tǒng)為自交親和，有時(shí)需要傳粉者;OC，I為4時(shí)，交配系統(tǒng)為部分自交親和，異交需要傳粉者。

花粉量及P/O值(花粉數(shù)/胚珠數(shù))的測(cè)定:隨機(jī)選取10棵樹，每棵樹隨機(jī)選取3朵花藥尚未開裂的小花，取小花的全部花藥，用 0.1 mol·L－1HCl溶液在60℃下水解去除藥壁，制成2 mL花粉粒懸浮液，吸取5 μL于顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)量，重復(fù)取樣觀察5次，取均值再乘以400(2 mL=5 μL×400)則為單花花粉數(shù)。取子房在解剖鏡下用解剖針劃開心皮，觀測(cè)并記錄胚珠數(shù)。最后計(jì)算花粉與胚珠的比值。按 Cruden［13］的標(biāo)準(zhǔn)，P/O為 2.7 ～5.4時(shí)，其交配系統(tǒng)為閉花受精;P/O為18.1～39.0時(shí)，交配系統(tǒng)為專性自交;P/O為31.9～396.0時(shí)，交配系統(tǒng)為兼性自交;P/O為244.7～2588.0時(shí)，交配系統(tǒng)為兼性異交;P/O為2108.0～195525.0時(shí)，交配系統(tǒng)為專性異交。

授粉試驗(yàn):選擇4株生長(zhǎng)狀態(tài)良好、間隔50 m以上、上一年天然狀態(tài)下結(jié)實(shí)率較高的刺槐個(gè)體，進(jìn)行完全雙列雜交。參考李昆等［12］描述的方法進(jìn)行下述處理:天然授粉，是不套袋，不去雄，自由傳粉，用于檢測(cè)自然條件下的傳粉情況;自交，對(duì)花進(jìn)行套袋但不去雄，檢測(cè)自交能力;雜交，套袋并且去雄，用不同植株的花粉進(jìn)行異花授粉;去雄不套袋，自然條件下異花傳粉，對(duì)花進(jìn)行去雄但不套袋，使去雄后的花在天然狀態(tài)下異花授粉;孤雌生殖，對(duì)花進(jìn)行去雄并套袋，但不授粉，使子房在沒(méi)有花粉的情況下生長(zhǎng)發(fā)育;競(jìng)爭(zhēng)授粉，對(duì)花進(jìn)行套袋但不去雄，人工授以異株花粉，在排除自交不親和以及去雄影響的前提下，觀察套袋對(duì)坐果率的影響。每種交配組合選5個(gè)花序，每花序保留10朵小花。在授粉后1周、1個(gè)月和3個(gè)月分別統(tǒng)計(jì)各交配類型的坐果率。其中坐果率=(結(jié)實(shí)數(shù)/開花數(shù))×100%。

試驗(yàn)所用的花除自然授粉和自交外，均在將開花期去雄。這一時(shí)期花瓣閉合，花藥未開裂，柱頭表面干凈無(wú)花粉。去雄后套袋隔離。授粉4 d(4 d時(shí)間足夠花粉管生長(zhǎng)到子房完成受精;4 d后柱頭可授性大大下降，新的花粉難以萌發(fā);去袋太晚會(huì)影響花的正常發(fā)育)后將硫酸紙袋去掉。人工授粉時(shí)間應(yīng)在去雄后2 d內(nèi)，否則柱頭干燥，且可授性差。在試驗(yàn)期間，對(duì)套袋的花朵經(jīng)常進(jìn)行檢查，并揭袋換氣，防止花朵霉壞，換氣時(shí)嚴(yán)格防止昆蟲在花序附近活動(dòng)。在授粉后1周(6月9日)、授粉后1個(gè)月(7月15日)以及授粉后4個(gè)月(10月20日)分別統(tǒng)計(jì)各交配組合的坐果率。由于4株樹中的1株在授粉后遭到了破壞，因此，只統(tǒng)計(jì)其余3株的坐果率。

3 結(jié)果與分析

3.1 花朵表型性狀

刺槐花為總狀花序、蝶形花、兩性花、雌雄同花，雄蕊10枚圍繞在雌蕊周圍。各雄蕊與柱頭距離并不一致，距離最短的1.5 mm左右，距離最長(zhǎng)的為4.5 mm左右。有些單株花萼為綠色，有些單株花萼略帶紅色(圖1A)?；ü跒榘咨?，開花時(shí)香氣濃郁。花的各項(xiàng)表型性狀，即:花序長(zhǎng)、花序直徑、小花長(zhǎng)、小花直徑、花柱長(zhǎng)、柱頭與花藥的最長(zhǎng)距離、柱頭與花藥的最短距離分別為(112.53±6.71)、(33.67±1.95)、(24.37±0.20)、(11.49±0.30)、(7.05±0.06)、(4.53±0.11)、(1.48±0.08)mm。

圖1 刺槐花形態(tài)、訪花昆蟲以及花粉管在花柱中生長(zhǎng)

3.2 花粉形態(tài)觀察

刺槐花粉近橢圓形，直徑15～30 μm，具3個(gè)萌發(fā)溝，萌發(fā)溝處著色較深(圖2A)?；ǚ弁獗诖植诰哂猩羁潭逦囊患?jí)網(wǎng)狀紋飾和微小的顆粒狀次級(jí)雕紋且富有黏性(圖2B)，是蟲媒花花粉粒的主要形態(tài)特征。因此，刺槐的花粉在形狀、大小和外壁表面紋飾等方面的特征符合蟲媒花的主要特征，花粉的形態(tài)特征與傳粉的方式是相適應(yīng)的，刺槐花粉的形態(tài)特征有利于花粉粘附在昆蟲身體上傳播。開花當(dāng)天落在柱頭上的花粉有些已經(jīng)開始長(zhǎng)出花粉管，花粉外形依然飽滿;開花24 h后柱頭上的花粉大量長(zhǎng)出花粉管，其外形開始皺縮(圖2F);開花48 h后柱頭上的花粉進(jìn)一步皺縮，大部分花粉已完成萌發(fā)。

3.3 花粉萌發(fā)

TTC法表明花粉在收集后24 h具有活力的占87.67%，收集后48 h具有活力的占23.78%，收集后72 h具有活力的占16.83%。

花粉管體內(nèi)生長(zhǎng)試驗(yàn)是將花粉授到提前去雄(去雄到授粉不超過(guò)2 d)的花的柱頭上，然后每隔一定時(shí)間觀察花粉管生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，授粉后2 h花粉已經(jīng)開始萌發(fā)(圖1C)，授粉后6 h已有少量花粉管生長(zhǎng)到花柱基部(圖1D)，授粉后24 h花粉管完全生長(zhǎng)到子房?jī)?nèi)(圖1E)，授粉后48 h花柱內(nèi)的花粉管依然清晰可見(jiàn)(圖1F)。

3.4 柱頭可授性

幼花期的柱頭干燥且缺乏黏液，可授性較差(圖2C);將開花期的柱頭上黏液較多，而且?guī)缀鯖](méi)有附著花粉，這一時(shí)期是去雄的好時(shí)機(jī)(圖2D);開花當(dāng)天柱頭黏液很多，表現(xiàn)出最佳的可授性，柱頭上已沾染大量的花粉粒，這一時(shí)期去雄已晚，但卻是授粉的最佳時(shí)期(圖2E);開花后24 h柱頭上依然有大量黏液，附著的花粉粒已經(jīng)萌發(fā)出花粉管(圖2F);開花后48 h柱頭上黏液明顯減少，有些柱頭開始解體，形狀變得不規(guī)則，說(shuō)明柱頭可授性開始下降(圖2G);開花后72 h柱頭上黏液已經(jīng)很少，柱頭進(jìn)一步降解，形狀更加不規(guī)則，此時(shí)柱頭可授性已經(jīng)很差(圖2H)。綜上所述，去雄的時(shí)機(jī)應(yīng)選在將開花期，然后，必須在去雄后2d內(nèi)完成授粉，這樣既可以防止柱頭被非目標(biāo)花粉污染，又可以使得柱頭與目標(biāo)花粉親和性最佳。另外，需要指出的是，利用掃描電鏡觀察時(shí)，柱頭已經(jīng)過(guò)干燥處理，但是黏液中含有的糖、氨基酸類物質(zhì)會(huì)使柱頭表面顯得模糊，觀察時(shí)看不清柱頭表面乳突結(jié)構(gòu)，據(jù)此可以判斷柱頭表面是否具有黏液。

圖2 花粉及柱頭表型的掃描電鏡觀察

3.5 刺槐傳粉媒介分析

3.5.1 風(fēng)媒傳粉觀測(cè)

用重力載玻片法檢測(cè)到刺槐花粉風(fēng)力傳播能力極其有限，每個(gè)單株載玻片上粘黏花粉數(shù)如表1。利用顯微鏡觀察載玻片，幾乎所有視野都觀察不到花粉，只有極個(gè)別視野內(nèi)分布有高度集中的花粉。如果把柱頭看成半球形，則其半徑最長(zhǎng)0.05 cm，表面積最大0.015 7 cm2(S=4πr2)。如表1，每平方厘米載玻片露置1 d后平均粘黏花粉量為7.50粒，則柱頭露置1 d平均粘黏花粉為0.1粒。這樣的效率說(shuō)明風(fēng)媒對(duì)刺槐傳粉的貢獻(xiàn)微乎其微。

3.5.2 蟲媒傳粉觀測(cè)

刺槐的花萼有的呈紅色，有的呈綠色，花冠呈白色，在綠葉襯托下非常顯眼。刺槐花香氣濃郁，對(duì)訪花者極具吸引力。刺槐種群記錄到的訪花者可分為3類:分別為膜翅目的蜂類和蟻類，以及雙翅目的蠅類。其中蜂類的蜜蜂為刺槐的最主要訪花昆蟲。蜜蜂訪花時(shí)身體位于旗瓣和龍骨瓣之間，頭部伸向花萼基部蜜腺處，后面的觸手蹬在龍骨瓣上。雌雄蕊此時(shí)失去龍骨瓣包裹，與蜜蜂腹部產(chǎn)生接觸，這使得花粉粘附在蜜蜂腹部及觸手上，而柱頭則接觸到蜜蜂攜帶的異源花粉，從而完成蟲媒傳粉過(guò)程(圖1B)。從表2可以看出晴好天氣有利于蜜蜂訪花，陰雨和大風(fēng)天會(huì)妨礙昆蟲的訪花行為。蠅類和蟻類訪花頻率極低，且很少直接與花藥柱頭接觸，因此，與蜜蜂相比，其傳粉作用非常微小。綜上所述，刺槐的傳粉方式主要是蟲媒傳粉。

表1 載玻片露置1 d后粘黏花粉粒數(shù) 粒

表2 蜜蜂訪花頻率統(tǒng)計(jì)

3.6 交配方式評(píng)判

3.6.1 刺槐雜交指數(shù)

刺槐花朵直徑(11.49±0.30)mm。刺槐柱頭可授性從開花前2 d延續(xù)到開花后2 d，這一時(shí)期也是花粉成熟散粉的時(shí)期，因此，可以認(rèn)為雌雄蕊成熟時(shí)間相同。雌雄蕊在空間上有所分離，雌蕊比雄蕊高1～5 mm。以上幾點(diǎn)使得刺槐雜交指數(shù)達(dá)到4。根據(jù) Dafni［14］和李昆等［12］的標(biāo)準(zhǔn)，該樹種的交配系統(tǒng)為部分自交親和，異交需要傳粉者(表3)。

表3 刺槐雜交指數(shù)

3.6.2 刺槐的花粉—胚珠比(P/O)

刺槐單花的平均胚珠數(shù)為(20.37±0.32)，單花的平均花粉數(shù)為(28 071.67±879.47)，花粉—胚珠比(P/O)約為 1 378.09。按 Cruden［13］的標(biāo)準(zhǔn)，刺槐的交配方式為兼性異交。

3.6.3 控制授粉試驗(yàn)坐果率統(tǒng)計(jì)

各交配組合在授粉1周、1個(gè)月、4個(gè)月后結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)如表4。

表4 控制授粉結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)

刺槐的果實(shí)到九十月份才能完全成熟。從10月20日的統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，天然授粉結(jié)實(shí)率(40.67%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他交配方式，自交結(jié)實(shí)率為18.00%，而雜交結(jié)實(shí)率為3.56%，去雄不套袋結(jié)實(shí)率為9.33%，孤雌生殖結(jié)實(shí)率為1.33%，競(jìng)爭(zhēng)授粉結(jié)實(shí)率為8.22%。從上述3個(gè)時(shí)期的統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，各交配組合在授粉后第1周內(nèi)落花率最高，此后直到果實(shí)成熟的幾個(gè)月時(shí)間內(nèi)，落花率大大下降，坐果率變化相對(duì)較小。

4 結(jié)論與討論

何亞平等［15］認(rèn)為自然界絕對(duì)自交或異交的植物種類很少，大多數(shù)為兩者兼而有之，即為混合交配的交配模式。植物近交會(huì)導(dǎo)致后代衰退，遠(yuǎn)交易受環(huán)境影響。自然選擇使刺槐形成了以異交為主，部分自交的混合交配系統(tǒng)。Surles et al.［6］以多地刺槐天然大群體為研究對(duì)象，利用等位酶標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)，天然狀態(tài)下刺槐80%以上為異交，這與本文觀點(diǎn)一致。而原法憲［7］認(rèn)為刺槐主要是以自交為主的樹種，其主要理由是刺槐在開花前，花藥就已經(jīng)開裂，從而使得柱頭上沾滿了花粉，這些花粉必然是自花花粉。本試驗(yàn)通過(guò)3年觀察也發(fā)現(xiàn)刺槐在開花前柱頭上就已經(jīng)沾滿了花粉這一現(xiàn)象。既然如此，那么為何 Surles et al.［6］和本文的研究結(jié)果都認(rèn)為刺槐是以異交為主的樹種呢?Hasegawa et al.［16］報(bào)道指出板栗在傳粉階段，自花傳粉占到90.2%，而到種子成熟時(shí)，自花傳粉所得種子僅僅占0.3%，因此，他指出自交不親和性強(qiáng)烈抑制了自花傳粉種子的生長(zhǎng)和發(fā)育。Kristina et al.［17］在研究Platypodium elegans時(shí)也發(fā)現(xiàn)，從授粉結(jié)束到種子成熟，再到幼苗長(zhǎng)出的過(guò)程中，自交后代個(gè)體所占的比例不斷下降，尤其從種子成熟以后到幼苗長(zhǎng)出這段時(shí)間下降更快。此外，他還指出自交所得種子的質(zhì)量明顯比異交得到的種子輕。據(jù)此，猜測(cè)刺槐也存在這一機(jī)制——從授粉到種子成熟再到幼苗長(zhǎng)出的過(guò)程，自交后代所占比例逐漸下降，最后存活的個(gè)體就主要是異交的后代。關(guān)于這一點(diǎn)還需要后續(xù)相關(guān)的種子成熟、萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的對(duì)比試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。Lian et al.［8］利用SSR分子標(biāo)記對(duì)從9棵單株上采集的種子進(jìn)行親本鑒定后認(rèn)為，這些種子大部分是自交個(gè)體。但該試驗(yàn)樣本取自無(wú)性系林分，樣本量小，僅有9個(gè)無(wú)性系，不足以說(shuō)明刺槐天然群體的交配類型。在無(wú)性系林分中，無(wú)性系之間的授粉會(huì)受其周圍的無(wú)性系個(gè)體影響，雖然是異株傳粉，但會(huì)有一定程度的相同基因型之間的雜交。因此，該試驗(yàn)結(jié)果不足以代表刺槐天然大群體的異交率。

載玻片粘黏花粉試驗(yàn)計(jì)算得出每平方厘米載玻片上平均黏著花粉數(shù)為7.50粒，這一結(jié)果只有假設(shè)花粉平均分布在載玻片上才可靠。事實(shí)上，花粉在載玻片上的絕大部分區(qū)域并沒(méi)有被觀察到，只有極個(gè)別的區(qū)域分布有高度集中的花粉粒。如果是風(fēng)媒傳粉，那么分布在載玻片上的花粉就應(yīng)該趨于分散。高度集中的花粉?？赡苁且?yàn)檩d玻片與雄蕊在風(fēng)的作用下直接接觸造成的，具體原因還需進(jìn)一步觀察。根據(jù)以上推測(cè)，認(rèn)為風(fēng)媒對(duì)刺槐的傳粉貢獻(xiàn)可以忽略不計(jì)，刺槐屬于蟲媒傳粉植物。觀察發(fā)現(xiàn)，蜜蜂采蜜時(shí)經(jīng)常就近訪問(wèn)同一株樹的不同花，這種同株異花授粉依然屬于自交，因?yàn)橥昊ǚ刍蛐拖嗤?。此外，由于蜜蜂就近采蜜，雜交的花粉來(lái)源也以鄰近的單株為主，這會(huì)使得雜交后代基因型與鄰近植株相近，變異幅度有限。

花粉萌發(fā)和柱頭可授性試驗(yàn)表明開花當(dāng)天散粉量最大，花粉收集后放入加硅膠的培養(yǎng)皿，常溫下保存24 h后萌發(fā)率可達(dá)80%以上，常溫下保存48 h后萌發(fā)率不到30%。野外雜交試驗(yàn)中，花粉采集后要盡快授粉，否則花粉活力會(huì)大大下降。柱頭可授性試驗(yàn)表明，柱頭適授期從開花前2 d持續(xù)到開花后2 d。早于這一時(shí)期，柱頭干燥，不易粘黏花粉。晚于這一時(shí)期，柱頭開始降解，形狀不規(guī)則，缺乏粘液，不利于花粉萌發(fā)。雜交試驗(yàn)去雄時(shí)機(jī)應(yīng)盡可能地晚，但是一定要在散粉前，這樣既可以把去雄對(duì)花發(fā)育的影響降到最小，又能保證柱頭不被自身花粉沾染。去雄后應(yīng)盡快(2 d內(nèi))完成授粉，否則花粉活力和柱頭可授性都將大大下降。

文中的授粉試驗(yàn)顯示，刺槐天然生長(zhǎng)結(jié)實(shí)率為4 0.66%，自交結(jié)實(shí)率為18%，雜交結(jié)實(shí)率為3.56%，孤雌生殖結(jié)實(shí)率為1.33%。本試驗(yàn)去雄套袋操作雖然嚴(yán)格防止自身和外界花粉污染，但是因?yàn)闆](méi)有對(duì)后代種子進(jìn)行染色體倍性分析，所以還不能肯定刺槐存在孤雌生殖的現(xiàn)象。

另外，從以上數(shù)據(jù)看出，刺槐天然生長(zhǎng)也存在落花落果現(xiàn)象，這和很多果樹的生理落花落果現(xiàn)象一致，但去雄雜交后刺槐落花落果率急劇增加，這就不是普通意義的生理落花落果，而一定是與去雄或套袋的人工操作有關(guān)。雜交過(guò)程需要去雄、套袋、授粉(本試驗(yàn)雜交所用的花粉已被證明是有活性的)三步人工操作，而自交只需要套袋一步人工操作。現(xiàn)假設(shè)自交和雜交坐果率低的原因只是套袋(套袋使花處于一個(gè)相對(duì)封閉的環(huán)境，花生長(zhǎng)環(huán)境中的溫度會(huì)升高，光照會(huì)減少，風(fēng)吹時(shí)袋對(duì)花有可能造成機(jī)械損傷作用)引起的，而與去雄無(wú)關(guān)，那么根據(jù)Surles et al.［6］的試驗(yàn)以及文中觀點(diǎn)，刺槐天然狀態(tài)下屬于高度異交樹種，外來(lái)花粉更有利于結(jié)實(shí)，由此推斷刺槐雜交結(jié)實(shí)率應(yīng)高于自交，但是從文中雜交試驗(yàn)結(jié)果看，雜交結(jié)實(shí)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于自交，那么在保證雜交所授花粉有活力的前提下，可以確定去雄是造成雜交結(jié)實(shí)率極低的最主要原因，此外，去雄不套袋花的結(jié)實(shí)率也低于天然生長(zhǎng)和自交，從而進(jìn)一步斷定去雄是影響花發(fā)育和結(jié)實(shí)率的主要因素。

按照這一推論，人工雜交所得結(jié)實(shí)率并不能反應(yīng)自然狀態(tài)下刺槐真實(shí)的異交結(jié)實(shí)率。從Dini－papanastasi et al.［3］的報(bào)道中也可發(fā)現(xiàn)刺槐雜交結(jié)實(shí)率低的現(xiàn)象。前人在蘭屬［18］和石竹屬［19］以及豇豆［20］等植物中發(fā)現(xiàn)去雄會(huì)加速花衰老。在酸櫻桃中已有去雄雜交會(huì)降低結(jié)實(shí)率的報(bào)道［21］。Hedhly et al.［22］研究甜櫻桃發(fā)現(xiàn)，去雄雜交后落花落果率明顯上升，并且去雄雜交后雌蕊在隨后9d內(nèi)重量增長(zhǎng)比天然個(gè)體的慢，去雄雜交后10 d內(nèi)胚珠退化率比天然個(gè)體高，并推測(cè)去雄后花器官乙烯含量上升是造成以上現(xiàn)象的重要原因之一。此外，從上述3個(gè)時(shí)期的統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，各交配組合在授粉后第1周內(nèi)落花率最高，直到果實(shí)成熟的三四個(gè)月時(shí)間內(nèi)，落花率大大下降，坐果率變化相對(duì)較小。因此，研究去雄授粉后1周內(nèi)花器官生理生化變化，對(duì)于了解去雄如何影響花發(fā)育及結(jié)實(shí)率的機(jī)理至關(guān)重要。綜上所述，去雄對(duì)刺槐花發(fā)育以及坐果率的影響是值得深入研究的問(wèn)題。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)刺槐是以異交為主的樹種，因此，雜交育種中使用外源花粉進(jìn)行授粉是可行的。另外，還發(fā)現(xiàn)了刺槐人工雜交結(jié)實(shí)率低的現(xiàn)象，如果該問(wèn)題能夠得到解決，那么將極大地提升刺槐的雜交育種工作水平。

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