王 軼 吳 瑩 王 洋 閻秀峰

(東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心/東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

喜樹(Camptotheca acuminataDecne)是我國特有的多年生亞熱帶落葉闊葉樹種，屬于珙桐科(Nyssaceae)喜樹屬，主要分布于長江流域及西南各省，因其次生代謝產(chǎn)物喜樹堿具有良好的抗腫瘤活性而受到人們的廣泛關(guān)注［1］。

一些叢枝菌根真菌能夠侵染喜樹的細(xì)根并與之共生形成叢枝菌根，有研究表明:喜樹幼苗中喜樹堿含量的變化與菌根真菌侵染及菌根形成過程具有相關(guān)性［2］。為了深入探討喜樹堿與共生關(guān)系及過程的相關(guān)機(jī)理，需要對(duì)喜樹幼苗不同級(jí)別細(xì)根中的喜樹堿進(jìn)行精細(xì)分析，測(cè)定微小根段中的喜樹堿含量。然而，目前常用的基于紫外檢測(cè)器的高效液相色譜方法測(cè)定喜樹堿含量［3－5］，實(shí)驗(yàn)操作中樣品質(zhì)量通常為1～2 g喜樹干樣，所需樣品量大且靈敏度不高，無法滿足上述研究工作需求。

借助于喜樹堿具有自發(fā)熒光的特性，作者建立了基于熒光檢測(cè)器的喜樹堿含量高效液相色譜測(cè)定方法，樣品量可以降低至2 mg(干質(zhì)量)，可以滿足微量植物材料中喜樹堿含量的精確測(cè)定。

1 材料與方法

儀器:高效液相色譜系統(tǒng)，包括515型單泵、717型自動(dòng)進(jìn)樣器、2475型熒光檢測(cè)器(美國Waters公司);Sorvall Legend Micro17型離心機(jī)(美國Thermo公司);H—H—2數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);Sartorius BT25S電子分析天平(精度0.01 mg);Bransonic—321超聲波清洗機(jī)。

實(shí)驗(yàn)材料:選取成熟飽滿的喜樹種子(來源于四川省金堂縣)，用0.5%的 KMnO4浸泡消毒0.5 h，無菌水洗凈后，播入經(jīng)過121℃滅菌2 h的細(xì)沙中催芽。待有側(cè)根生成后栽植于已滅菌的花盆中，每盆1株，盆中基質(zhì)為土壤與河沙混合物(體積比3∶1，過2 mm篩，混合后121℃滅菌2 h)。移苗后于自動(dòng)控制溫室中培養(yǎng)，溫室為自然采光，晝夜溫度自然過渡(18～28℃)。40 d后對(duì)喜樹幼苗根、莖、葉、子葉及全株分別采樣，樣品烘干后用于喜樹堿含量測(cè)定。

試劑與藥品:喜樹堿對(duì)照品(批號(hào):080510)由哈爾濱峰源高科技開發(fā)有限公司提供，經(jīng)HPLC測(cè)定純度大于99%。乙腈為色譜純(Fisher公司)，娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。其他試劑均為分析純。

對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備:精密稱取喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品1 mg置于50 mL容量瓶中，加乙腈超聲使其溶解，待冷卻后再用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品儲(chǔ)備液(20 mg·L－1)。將對(duì)照品儲(chǔ)備液分裝后，于冰箱中－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品溶液的制備:取干燥至恒質(zhì)量的喜數(shù)幼苗葉片材料于研缽中研磨成粉末，精密稱取2 mg喜樹葉粉置于5 mL容量瓶中，加入4 mL 61%乙醇，50℃下超聲提取10 min后取出，冷卻至室溫后定容。搖勻后經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取濾液作為樣品溶液。

2 結(jié)果與分析

波長選擇與HPLC色譜條件確定:以質(zhì)量濃度為1 mg·L－1的喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，摸索喜樹堿熒光檢測(cè)的最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長。首先，以喜樹堿的最大紫外吸收波長作為激發(fā)波長，掃描喜樹堿熒光的發(fā)射波長;然后，以所得的最大發(fā)射波長，進(jìn)一步掃描激發(fā)波長;如此反復(fù)，最終確定最佳熒光檢測(cè)條件。結(jié)果顯示:針對(duì)喜樹堿的最佳激發(fā)波長為380 nm，發(fā)射波長為553 nm。

經(jīng)試驗(yàn)，確定HPLC色譜條件為:Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;以乙腈 ∶水(體積比4 ∶6)為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫;流速 1.0 mL·min－1;熒光檢測(cè)激發(fā)波長380 nm，發(fā)射波長553 nm;進(jìn)樣量20 μL。對(duì)照品和樣品色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察:取對(duì)照品儲(chǔ)備液(20 mg·L－1)準(zhǔn)確稀釋成為20、40、80、160、200、320、400、800 μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，按照本文確定的色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=5 968.6X+2 447.9，r=0.999 6，喜樹堿溶液質(zhì)量濃度在20～800 μg·L－1范圍內(nèi)，與峰面積的線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取喜樹葉片材料，按本文的方法制備樣品溶液。吸取同一份樣品溶液，按本文確定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%，精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取喜樹葉片材料，按本文的方法制備樣品溶液，于室溫下分別放置 0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣分析，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%。表明:樣品溶液在24 h內(nèi)，測(cè)定結(jié)果基本保持穩(wěn)定。

圖1 喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品及喜樹幼苗樣品HPLC色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn):取喜樹葉片材料研磨、混勻后，精密稱取6份;按本文的方法制備樣品溶液;按本文確定的色譜條件進(jìn)樣分析。計(jì)算得:喜樹堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.911 mg·g－1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.4%。重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn):精密稱取6份已知喜樹堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.911 mg·g－1)的喜樹葉片粉末各 1 mg，分別加入喜樹堿對(duì)照品儲(chǔ)備液(20 mg·L－1)45.6 μL(加入量0.912 μg)，按本文的方法制備樣品后，按照本文確定的色譜條件進(jìn)樣分析。喜樹堿的平均回收率為98.41%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.88%(見表1)。

表1 喜樹葉片中喜樹堿的加樣回收率

樣品測(cè)定:準(zhǔn)確量取喜樹幼苗根、莖、葉、子葉和全株的樣品各3份，按本文的方法制備樣品，按照本文確定的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算喜樹堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)(見表2)。無論是喜樹堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的葉片樣品，還是質(zhì)量分?jǐn)?shù)低一些的根樣品，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小。

表2 喜樹幼苗中喜樹堿含量(n=3)

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種基于HPLC—熒光檢測(cè)的微量喜樹植物材料中喜樹堿含量的測(cè)定方法，只需2 mg(干質(zhì)量)喜樹材料即可實(shí)現(xiàn)對(duì)喜樹堿含量的提取和測(cè)定，相對(duì)于現(xiàn)有基于HPLC—紫外檢測(cè)的喜樹堿含量測(cè)定方法大大減小了測(cè)定樣品需要量。

相對(duì)于紫外檢測(cè)器而言，熒光檢測(cè)具有更高的靈敏度，因此適用于微量物質(zhì)的檢測(cè)。HPLC—熒光檢測(cè)器測(cè)定喜樹堿含量的方法，已用于動(dòng)物血漿中各種喜樹堿衍生物的含量測(cè)定［6－8］;但對(duì)于以喜樹植物材料為樣品的喜樹堿含量測(cè)定，目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道。在對(duì)叢枝菌根真菌與喜樹幼苗共生關(guān)系的研究中，需要對(duì)喜樹幼苗不同級(jí)別細(xì)根中的喜樹堿進(jìn)行精細(xì)分析，測(cè)定微小根段中的喜樹堿含量，采用HPLC—熒光檢測(cè)法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的紫外檢測(cè)法成為解決問題的關(guān)鍵。以2 mg干質(zhì)量的植物樣品用于喜樹堿的提取和含量測(cè)定，可以滿足對(duì)一株喜樹幼苗不同根段、不同組織部位的微量樣品進(jìn)行喜樹堿含量測(cè)定的需求。這對(duì)今后進(jìn)一步研究叢枝菌根對(duì)喜樹幼苗生長發(fā)育情況的影響以及喜樹中喜樹堿的合成及代謝機(jī)制提供了更精準(zhǔn)可靠的方法。

［1］Wall M E，Wani M C，Cook C E，et al.Plant antitumor agentsⅠ:The isolation and structure of camptothecin a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor fromCamptotheca acuminate［J］.Journal of the American Chemical Society，1966，88:3888－3890.

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