權(quán)青云 楊嫣華 李宏圖 李 峰 趙曉娟 林芝惠

癲癇間是一組由大腦神經(jīng)元異常放電所引起的一組臨床癥狀，對患者及社會造成較大危害，尤其是對患者認知功能的損害。目前國內(nèi)外研究已證實在成年哺乳動物，包括人類的整個生命過程中海馬齒狀回均有新生的神經(jīng)元產(chǎn)生［1］。近年不少報道關于癇間性發(fā)作誘導的損傷刺激海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）的內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞的神經(jīng)發(fā)生［2］?？拱d癇間藥是目前控制癲癇間癥狀的最主要的治療方法。雖抗癲癇間藥對癲癇間后海馬DG新生成熟神經(jīng)元的產(chǎn)生已有報道［3］，但這些新生神經(jīng)元與認知之間的關系報道較少。本實驗運用氯化鋰和匹羅卡品聯(lián)合誘導成年大鼠癲癇間持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）模型，通過5－溴脫氧尿核苷（5－bromodeoxyuridine，Brd U）標記新生的神經(jīng)細胞，利用Brd U與神經(jīng)元核性蛋白（Neu N）雙標記觀察卡馬西平（Carbamazepine，CBZ）對海馬齒狀回內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞分化為成熟神經(jīng)元的情況，同時利用行為學分析評價大鼠的空間記憶，為進一步探討卡馬西平對癲癇間患者認知影響提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及藥品 氯化鋰、匹羅卡品、Brd U（5 g／支）均購自sigma公司；大鼠來源抗Brd U單克隆抗體（100 ug／支）購于Santa公司；小鼠來源的Neu N抗體（500 ug／支）購于Chemicon公司；生物素化山羊抗大鼠Ig G抗體、生物素化馬抗山羊IgG抗體、辣根過氧化物酶標記的鏈酶親和素購于sigma公司；Alexa Fluor 594山羊抗大鼠IgG（H＋L）（0.5 ml／支）購于 molecule probe；Alexa Fluor 488猴抗小鼠IgG（H＋L）抗體（0.5 ml／支）購于 molecule probe。

CBZ，商品名：得理多，200 mg／片，北京諾華制藥有限公司，國藥準字H11022279。

行為學分析環(huán)境：安靜的測試室，燈光、光線均勻，不透明的塑料測試箱（60 cm×42 cm×37 cm），SONY數(shù)碼攝像機，3個尺寸相同，形狀、顏色不同的物體，其中2個完全相同，體積為大鼠體積的1／2～1倍，重量大于大鼠體重。

1.1.2 動物來源及飼養(yǎng)條件 32只Sprague－Dawley（SD）成年雄性大鼠，體重200 g（購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心），動物飼養(yǎng)室12 h光－暗循環(huán)（6：00－18：00），溫度20～25℃，濕度30～60%，食物和水自由攝取。喂養(yǎng)5 d后開始進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 SE模型制作及分組 腹腔注射氯化鋰（180 mg／kg），20 h后腹腔注射匹羅卡品（30 mg／kg），當大鼠癇間性發(fā)作達Ⅳ級或Ⅳ級以上并持續(xù)達90 min或抽搐致瀕危時給予腹腔注射苯巴比妥鈉50 mg／kg終止發(fā)作［4］。發(fā)作級別按 Racine分級［5］，癇間性發(fā)作達到Ⅳ級或以上，解除癇間性發(fā)作后狀態(tài)良好者視為合格SE模型。正常大鼠以相同容積的0.9%氯化鈉取代氯化鋰、匹羅卡品和苯巴比妥鈉。隨機分為4小組（正常對照組，SE組，CBZ組，SE＋CBZ組），每小組各8只大鼠。

1.2.2 藥物用法 于SE后5 h給各大鼠分別灌胃，正常對照組（蒸餾水，1 ml／200 g），CBZ組（CBZ 120 mg·kg－1·d－1，4 mg／ml，1 ml／200 g）［6］，2次／d，8：00－20：00。于SE后第6 d為各大鼠腹腔注射Brd U（50 mg／kg），共2次，間隔2 h。

1.2.3 行為學檢測方法［7］

在處死前3 d各組大鼠每天熟悉適應測試箱45 min，同時熟悉適應空測試盒5 min，連續(xù)3 d后進行測試。（1）將每只大鼠置于鋪有墊料的測試盒適應1 min；（2）在測試盒規(guī)定的位置放入2個完全相同的物體，觀察大鼠探索物體15 min后（熟悉階段），將大鼠放至動物房；（3）3 h后將大鼠及兩個不同的物體（其中1個是熟悉的物體）同時再次放入測試盒，觀察大鼠探索物體15 min（測試階段）。在測試過程中整個過程被攝像機記錄。觀察每只大鼠探索兩個物體的累計時間及測試階段探索物體前30 s中探索新物體所占比例，并進行分析。大鼠探索物體的主要標準：（1）大鼠的鼻子指向物體的距離必須小于它頭的長度；（2）大鼠探索物體的過程胡須必須運動。排除標準：（1）站在物體上頭向別處張望；（2）身體不經(jīng)意接觸物體；（3）趴在物體上、靠著物體不動。在下一個大鼠測試前每個物體和測試盒均用75%酒精徹底擦洗。

1.2.4 取材 分別給以各組大鼠戊巴比妥鈉（50 mg／kg）過量麻醉后，打開胸腔，由心尖經(jīng)二尖瓣至主動脈，0.9%氯化鈉100 ml快速灌注，然后4%多聚甲醛400 ml先快后慢灌注30 min，取腦，4%多聚甲醛后固定2 h，20%蔗糖溶液沉底。冰凍切片機切片，留取海馬部位連續(xù)冠狀位切片，片厚30μm，每隔5張取一張腦片為一組收集于0.01M磷酸鉀鹽緩沖 生 理 鹽 水 （potassium phosphate－buffered saline，KPBS）中備用。

1.2.5 免疫熒光染色 取各組大鼠的其中1組腦片，（1）行Brd U變性；（2）加大鼠抗Brd U單克隆抗體（1∶500）及小鼠抗 Neu N 單克隆抗體（1∶200）4℃孵育36 h；（3）避光環(huán)境下加山羊抗大鼠（1∶500）及驢抗小鼠（1∶500）熒光二抗室溫下孵育4 h；（4）避光環(huán)境下貼片，50%甘油封片，使用日本OLYMPUS X2100共聚焦顯微鏡觀察照相。

2 結(jié) 果

2.1 行為學分析 各組大鼠探索兩個物體行為的總時間無明顯差異（P＞0.05）（圖1A）。但是3 h后測試，對照組及CBZ＋SE組大鼠在探索物體的前30 s時間內(nèi)探索新物體的所占比例明顯高于SE組（P＜0.05）（圖1B）。

2.2 各組大鼠海馬DG區(qū)新生神經(jīng)細胞分化為成熟神經(jīng)元的情況 日本OlympusBX2100共聚焦顯微鏡下（×400倍）觀察發(fā)現(xiàn)，各組大鼠海馬DG區(qū)Brd U／NeuN雙陽性細胞主要分布在顆粒細胞層，少數(shù)分布在門區(qū)，呈單個或兩個，沒有叢集性，細胞核形態(tài)比較規(guī)則（圖2A）。SE組海馬齒狀回顆粒細胞層Brd U／NeuN雙陽性細胞數(shù)較正常對照組明顯減少（P＜0.05），但是SE＋CBZ組Brd U／NeuN雙陽性細胞數(shù)量與SE組相比明顯增多（P＜0.05）（圖2B）。

圖1 A 各組大鼠探索物體總時間（s）

圖1 B 各組大鼠探索物體前30 s內(nèi)探索新物體所占比例

圖2 A 各組大鼠齒狀回新生成熟神經(jīng)元情況（×400倍）

圖2 B 各組大鼠平均每只大鼠海馬齒狀回Brd U／Neu N＋細胞的數(shù)量

3 討 論

本實驗采用氯化鋰－匹羅卡品腹腔注射造模，整個發(fā)作過程同人類SE相似。在SE后5 h給大鼠灌胃CBZ，發(fā)現(xiàn)CBZ明顯促進新生神經(jīng)細胞存活，并增加新生成熟神經(jīng)元產(chǎn)生，與以往研究結(jié)果大致一致［8］。同時，從行為學分析發(fā)現(xiàn)，CBZ抗癲癇間治療后的SE大鼠空間記憶、學習能力明顯改善。而癲癇間大鼠探索新物體與舊物體的時間各占一半，提示癲癇間大鼠空間記憶能力明顯下降，與以往實驗結(jié)果一致［7］。因此，可以推測CBZ較長時間抗癲癇間治療明顯提高新生成熟神經(jīng)元產(chǎn)生，是CBZ改善癲癇間大鼠的空間記憶、學習能力的實驗室依據(jù)之一。

目前AEDs癲癇間藥物是臨床治療癲癇的最主要、最有效手段之一，CBZ為三環(huán)類抗驚厥劑，是目前傳統(tǒng)的AEDs之一，臨床應用廣泛，對癲癇間精神運動性發(fā)作、大發(fā)作、限局性發(fā)作及混合性發(fā)作均有效。由于癲癇間具有不可預測性、發(fā)作性、長期服藥性等特點，不少患者誤認為癲癇間發(fā)作只要在發(fā)作期控制即可，對生命造成的威脅不大，長期服用較繁瑣，依從性不高。因此，臨床觀察癲癇間患者不正規(guī)抗癲癇間治療癲癇間患者均存在不同程度的智能損害，并且越嚴重的癲癇間發(fā)作智能損害越嚴重，這在以往的研究中也已證實［9］。本實驗結(jié)果顯示，在癲癇間后CBZ干預28 d后發(fā)現(xiàn)新生成熟神經(jīng)元明顯增多，同時行為學研究發(fā)現(xiàn)雖然此組大鼠探索物體的累計時間與其他組別無明顯差別，但在探索物體30 s時間內(nèi)探索新物體所占的時間比例明顯高于SE組，幾乎與正常對照組相同。對于這一現(xiàn)象，本研究推測CBZ可以改善SE大鼠的空間記憶能力。另外，本實驗發(fā)現(xiàn)SE組大鼠自發(fā)性癲癇間發(fā)作頻繁，CBZ干預SE組大鼠在實驗14 d后幾乎無自發(fā)性癲癇間發(fā)作。這也為臨床上我們發(fā)現(xiàn)癲癇間患者長時間服用CBZ，可控制癲癇間發(fā)作，并且有助于改善患者智能提供理論依據(jù)。

盡管我們發(fā)現(xiàn)長時間CBZ抗癲癇間干預治療可以有效控制癲癇間癥狀，增加新生成熟神經(jīng)元的產(chǎn)生，同時有效改善癲癇間大鼠的空間記憶、學習能力。但這些新生成熟神經(jīng)元在改善智能方面的作用機制還需進一步研究。正確引導新生神經(jīng)元發(fā)揮正面的、積極的作用將會為癲癇間患者帶來新的希望。

1 Chen J，Cai F，Cao J，et al.Long－term antiepileptic drug administration during early ife inhibits hippocampal neurogenesis in the developing brain.J Neurosci Res，2009，87（13）：2898－2907.

2 Jessberger S，Zhao C，Toni N，et al.Seizure－associated，aberrant neurogenesis in adult rats characterized with retrovirus－mediated cell labeling.Neurosci，2007，27（35）：9400－9407.

3 Jing Chen，Qing Yunguan，F(xiàn)ang Yang，et al.Effects of lamotrigine and topiramate on hippocampal neurogenesis in experimental temporal－lobe epilepsy.Brain research，2010，13（13），270－282.

4 Fang Yang，Jin Cunwang，Jun－Liang Han，et al.Different Effects of Mild and Severe Seizures on Hippocampal Neurogenesis in A－dult Rats.Hippocampus，2008，18（5）：460－468.

5 Kreicbergs A，Tribukait B，Willems J，et al.DNA flow analysis of soft tissue tumors.Cancer，1987，59（1）：128－133.

6 Jari Nissinena，Asla Pitkanen.Effect of antiepileptic drugs on spontaneous seizures in epileptic rats.Epilepsy Research，2007，73（2）：181－191.

7 Jessberger S，Nakashima K，Clemenson Jr GD，et al.Epigenetic Modulation of Seizure－Induced Neurogenesis and Cognitive Decline.J Neurosci，2007，27（22）：5967－5975.

8 權(quán)青云，林芝惠，徐曉霞，等.卡馬西平對匹羅卡品誘導成年癲癇間大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響.卒中與神經(jīng)疾病，2011，18（2）：78－81，92.

9 李茂林，權(quán)青云，林芝惠.不同程度的癇間性發(fā)作對成年大鼠空間學習記憶影響的研究.腦與神經(jīng)疾病雜志，2010，18（2）：148－151.