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松花粉抗氧化活性與主要成分的關(guān)聯(lián)分析

2012-06-14 07:02董素哲裴瑾劉薇張祎楠萬(wàn)德光
中藥與臨床 2012年3期
關(guān)鍵詞:破壁甾醇羥基

董素哲,裴瑾,劉薇,張祎楠,萬(wàn)德光

松花粉(Pollenpini)是松科植物馬尾松(Pinus massonina Lamb)、油松(Pinus tabulaefermis Carr)或同屬數(shù)種植物的干燥花粉,具有燥濕,收斂止血的功效[1]。作為祖國(guó)醫(yī)藥學(xué)寶庫(kù)中食、藥兼用的花粉品種,松花粉的應(yīng)用非常廣泛。由于松花粉具有提高抗氧化能力,增強(qiáng)免疫功能,延緩衰老[2]等作用,本論文以清除羥基自由基、清除DPPH自由基的能力為指標(biāo),分別對(duì)不同來(lái)源松花粉的抗氧化性進(jìn)行了研究;同時(shí)測(cè)定總黃酮、總甾醇與總多糖的含量,并對(duì)其與清除自由基的IC50進(jìn)行多元相關(guān)分析,以探討松花粉抗氧化作用的活性部位,為松花粉質(zhì)量控制和藥用資源的開(kāi)發(fā)提供依據(jù),同時(shí)也為松花粉破壁與否提供一定的參考。

1 儀器與材料

松花粉、破壁松花粉(來(lái)源詳見(jiàn)表1);蘆丁對(duì)照品、D-葡萄糖對(duì)照品、β-谷甾醇對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);DPPH(美國(guó)Sigma公司)。KQ5200E型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)、UV-1100分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)、BP121S電子天平(德國(guó)Sartorrius)等。

2 方法

2.1 抗氧化能力的測(cè)定

稱(chēng)取2.0 g松花粉于錐形瓶中,加入40 mL95%乙醇超聲提取40 min,靜置,分別取上清液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置于10 mL容量瓶中,定容,得待測(cè)液,用于清除DPPH自由基的測(cè)定。分別稱(chēng)取松花粉0.1 g、0.3 g、0.5 g、0.7 g、0.9 g于錐形瓶中,加入50 mL95%乙醇超聲提取40 min,靜置,取上清液為待測(cè)液用于清除羥基自由基的測(cè)定。采用文獻(xiàn)[3]的方法分別測(cè)定其清除DPPH自由基與羥基自由基的能力。

2.2 總黃酮、總甾醇、總多糖的含量測(cè)定[4~6]

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法,以蘆丁為對(duì)照品,用紫外分光光度法在500 nm處測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)曲線A=11.349C+0.0001,R2=0.9999,在8.08~48.48 μg.mL-1線性關(guān)系良好。用濃硫酸顯色法,以β-谷甾醇為對(duì)照品,用紫外分光光度法在416 nm處測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)曲線A=5.5268C-0.0019,R2=0.9996,在16.0~80.0 μg.mL-1線性關(guān)系良好。用苯酚-濃硫酸法,以D-葡萄糖為對(duì)照品,用紫外分光光度法在492 nm處測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)曲線A=25.327x+0.1592,R2=0.9998,在11.2~56.6 μg.mL-1線性關(guān)系良好。

2.3 量效曲線的擬合

通過(guò)檢測(cè)不同濃度的樣品對(duì)自由基的清除率,在不同濃度范圍內(nèi)進(jìn)行曲線擬合,以相關(guān)系數(shù)R2為指標(biāo)確定樣品濃度檢測(cè)范圍,以自由基清除率為50%時(shí)樣品的濃度(IC50)來(lái)衡量樣品對(duì)自由基的清除能力,IC50越小,表明樣品清除自由基的能力越強(qiáng),每種樣品取3份,平行測(cè)定,取其平均值計(jì)算。

根據(jù)自由基清除率范圍來(lái)確定樣品濃度范圍,自由基清除率在10%~90%時(shí)相關(guān)性較好,在該范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)大于0.95,不同部位樣品量效關(guān)系呈y=ax+b相關(guān)性,y為清除率(%),x為樣品濃度(g/mL)。

2.4 多元相關(guān)分析

分別采用SPSS17.0、OFFICE EXCEL兩種數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)清除DPPH自由基的IC50、清除羥基自由基的IC50與總黃酮、總甾醇、總多糖的含量做多元相關(guān)性分析。

3 結(jié)果

3.1 DPPH自由基清除能力

試驗(yàn)結(jié)果顯示,一定濃度范圍內(nèi)樣品的對(duì)數(shù)濃度與自由基清除率呈線性關(guān)系,清除率在10%~90%時(shí),線性關(guān)系良好,所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.95,因此,本方法的吸光度可較好的反映自由基清除率。IC50反映了清除自由基的能力,IC50越小,則清除自由基的能力(即抗氧化能力)越大,反之亦然。結(jié)果表明,松花粉具有良好的清除DPPH自由基的能力,不同來(lái)源的松花粉的清除能力存在一定差異,破壁松花粉的清除能力(IC50平均值為12.95 g.L-1)略高于未破壁松花粉(IC50平均值為14.86 g.L-1),詳見(jiàn)表1。

3.2 羥基自由基清除能力

試驗(yàn)結(jié)果表明,松花粉具有良好的清除羥基自由基的能力,不同來(lái)源樣品的清除能力存在一定差異;破壁松花粉的清除羥基自由基的能力(IC50平均值為3.45 g.L-1)明顯高于未破壁松花粉(IC50平均值為20.31 g.L-1),詳見(jiàn)表1。

3.3 總黃酮、總甾醇、總多糖的含量

試驗(yàn)結(jié)果表明,不同來(lái)源松花粉中總黃酮(0.16~0.75%)和總甾醇(0.98~7.67%)的含量差異較為明顯,而總多糖的含量則相差不大(5.25~6.98%);破壁松花粉中總黃酮和總甾醇的平均含量分別為0.68%、4.13%,略高于未破壁松花粉,其平均含量分別為0.27%、3.94%,詳見(jiàn)表1。

表1 清除DPPH、羥基自由基與含量測(cè)定試驗(yàn)(n=3)

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3.4 清除自由基能力與總黃酮、總甾醇、總多糖含量的關(guān)聯(lián)分析

通過(guò)多元相關(guān)分析表明,清除DPPH的IC50、清除羥基自由基的IC50分別與總黃酮、總甾醇的含量有負(fù)相關(guān)關(guān)系,與總多糖的含量有正相關(guān)關(guān)系;其中,與總黃酮含量的負(fù)相關(guān)關(guān)系最為密切,詳見(jiàn)表2。

表2 清除自由基能力與總黃酮、總甾醇、總多糖含量的多元相關(guān)分析

4 結(jié)論與討論

松花粉作為生命的遺傳物質(zhì),富含蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、維生素、脂類(lèi)等多種營(yíng)養(yǎng)成分,以及酶、輔酶、激素、黃酮、多肽、微量元素等生理活性物質(zhì),因此有“微型營(yíng)養(yǎng)庫(kù)”之美譽(yù)。在國(guó)內(nèi)外已被廣泛地應(yīng)用于保健品、藥品、化妝品和飼料添加劑等領(lǐng)域。松花粉藥食兼用的歷史已逾數(shù)千年,我國(guó)利用松花粉的歷史至少可追溯到2400年前,《神農(nóng)本草經(jīng)》中就記載“松黃”“久服輕身益氣力,延年”,同時(shí)現(xiàn)代研究也表明松花粉具有提高抗氧化能力,增強(qiáng)免疫功能,延緩衰老,保護(hù)心腦血管,降低血脂等功效[7]。

本論文采用清除DPPH和羥基自由基的方法來(lái)評(píng)價(jià)松花粉的體外抗氧化活性,結(jié)果表明松花粉具有一定的抗氧化能力。松花粉清除DPPH自由基的能力優(yōu)于清除羥基自由基的能力;不同來(lái)源松花粉樣品間清除羥基自由基能力的差異較其清除DPPH自由基的能力明顯;破壁松花粉的清除能力明顯優(yōu)于未破壁松花粉,提示松花粉破壁的必要性。

黃酮與甾醇的抗氧化作用已被公認(rèn),松花粉含有多種黃酮類(lèi)化合物,主要為黃酮和黃酮醇類(lèi),其次是二氫黃酮醇類(lèi)。中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所研究松花粉中含有豐富的甾醇,并用二氧化碳超臨界提取物制成降血脂的產(chǎn)品,把植物甾醇列為產(chǎn)品的有效成分指標(biāo)[8]。本論文測(cè)定了不同來(lái)源松花粉的總黃酮、總甾醇與總多糖的含量并對(duì)其與抗氧化性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,以尋找松花粉抗氧化的活性成分。結(jié)果表明不同來(lái)源的松花粉總黃酮與總甾醇的含量存在較大的差異。松花粉清除羥基自由基、清除DPPH的能力與總黃酮、總甾醇的含量呈正相關(guān),其中,總黃酮的相關(guān)性更高。而樣品間總多糖的含量差異較小,且與抗氧化能力關(guān)聯(lián)性不大。初步推測(cè)總黃酮與總甾醇為松花粉抗氧化的活性組分,從而為以后松花粉活性成分的研究和其質(zhì)量控制提供了一定的依據(jù)和基礎(chǔ)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2005,147.

[2] 何曉燕.松花粉的有效成分及藥理作用[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,35(9):78.

[3] 樊青玲,張耀兮,李天才.藜葉中黃酮類(lèi)化合物體外抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2009,21:672.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2005,333.

[5] 莊華梅,雷然,付惠.野生半夏中β-谷甾醇含量的測(cè)定[J].湖北林業(yè)科技,2007,3:19.

[6] 劉敏,郭麗梅,張麗.苯酚-硫酸法測(cè)定油松花粉多糖含量研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(6):1526.

[7] 劉協(xié).松花粉的抗疲勞作用研究[J].中國(guó)生化藥物雜志,2004,25(3):169.

[8] 王開(kāi)發(fā).花粉的植物甾醇研究[J].蜂蜜雜志,2006,9:5.

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