徐瑞超，馬云桐

虎杖主含蒽醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、芪類(lèi)化合物等成分，現(xiàn)代藥理研究證明具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、抗菌和治療心血管疾病的作用[1～4]，其中多酚類(lèi)化合物白藜蘆醇對(duì)人體具有降血脂、抗血栓、預(yù)防動(dòng)脈硬化以及增強(qiáng)免疫功能等重要調(diào)節(jié)作用，并成為具有研究前景的抗癌藥物之一[5～7]，因而對(duì)白藜蘆醇的需求量逐日增大。為了保護(hù)虎杖野生資源，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)開(kāi)展虎杖組織和細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)白藜蘆醇具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)采用Box-Behnken法優(yōu)化虎杖愈傷組織的培養(yǎng)條件，以誘導(dǎo)出生長(zhǎng)旺盛、質(zhì)地疏松的愈傷組織，篩選出虎杖愈傷組織誘導(dǎo)、繼代的最佳培養(yǎng)條件，為虎杖細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

虎杖原植物采自于四川省峨眉山，經(jīng)馬云桐教授鑒定為虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.，取健康、無(wú)病蟲(chóng)害的植株為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒與培養(yǎng) 選取幼嫩虎杖，用流水沖洗干凈，75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水洗滌3次，再用0.1%升汞溶液消毒10 min，無(wú)菌水沖洗5～7次，切成0.5 cm大小，接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃，空氣濕度為60%左右，光照強(qiáng)度1200 lx，光照12 h/d。

1.2.2 不同外植體誘導(dǎo)試驗(yàn) 分別選用虎杖葉柄、葉片和莖作為外植體，接入下列培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d后，計(jì)算其誘導(dǎo)率。其中蔗糖用量為30 g.L-1，瓊脂粉為7 g.L-1。

Ⅰ MS+6-BA 2.0 mg.L-1+KT 0.3 mg.L-1+2,4-D 0.5 mg.L-1+NAA 0.3 mg.L-1

Ⅱ MS+6-BA 3.0 mg.L-1+KT 0.2 mg.L-1+2,4-D 0.5 mg.L-1

Ⅲ MS+NAA 2.0 mg.L-1+KT 0.1 mg.L-1

Ⅳ MS+6-BA 0.4 mg.L-1+NAA 1.2 mg.L-1

Ⅴ MS+CPPU 0.5 mg.L-1+NAA 0.2 mg.L-1

1.2.3 光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)的對(duì)比試驗(yàn) 以上試驗(yàn)完成后，選擇最佳外植體（葉柄），于相應(yīng)最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中接種40瓶，接種后取20瓶進(jìn)行暗培養(yǎng)，剩余20瓶進(jìn)行正常光培養(yǎng)。試驗(yàn)重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織增殖率。

愈傷組織的生長(zhǎng)量的測(cè)定：接種前先稱(chēng)取帶培養(yǎng)基的空瓶重，記錄數(shù)據(jù)，接種后再稱(chēng)取重量，兩次重量之差便是初始接種物的初重量。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，取出培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到已稱(chēng)量好瓶重的新鮮培養(yǎng)基上，再稱(chēng)量，記錄數(shù)據(jù)，前后重量之差即為培養(yǎng)物的生長(zhǎng)量。

1.2.4 不同的激素水平對(duì)虎杖愈傷組織增殖的影響 在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面方法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)，選擇6-BA濃度、KT濃度、2,4-D濃度3個(gè)因素，做3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（5個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，通過(guò)Design Expert 7.1.3軟件，對(duì)虎杖愈傷組織培養(yǎng)工藝進(jìn)行分析，建立數(shù)學(xué)模型，得到最佳工藝參數(shù)。因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基不同激素及濃度對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)情況（見(jiàn)表2）

表2 不同的培養(yǎng)基對(duì)虎杖愈傷組織的誘導(dǎo)情況

接種7 d后，觀察可見(jiàn)：莖尖在Ⅲ號(hào)培養(yǎng)基的切口處開(kāi)始膨大，接種9 d后葉柄在Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基的兩端口開(kāi)始膨大；Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基里葉片作為外植體到12 d左右開(kāi)始膨大、卷曲。10 d左右莖尖周?chē)霈F(xiàn)顆粒狀愈傷組織，出愈時(shí)間莖尖>葉柄>葉片。葉柄在Ⅴ號(hào)培養(yǎng)基未能誘導(dǎo)出愈傷，在Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率最高為92%。葉片在Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率達(dá)100%，同時(shí)污染率最低。莖尖雖然出愈時(shí)間最短，可是污染率偏高，其次為葉柄。莖尖誘導(dǎo)的愈傷組織顏色淡黃白色，質(zhì)稍疏松，其次為葉柄，葉片誘導(dǎo)的愈傷組織淡黃綠色，顆粒大，質(zhì)地稍堅(jiān)硬。由于莖尖污染率較高，由此葉柄為虎杖愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體，相應(yīng)的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)激素為：Ⅱ MS+6-BA3.0 mg.L-1+KT0.2 mg.L-1+2,4-D0.5 mg.L-1。

2.2 光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)對(duì)虎杖愈傷組織生長(zhǎng)的影響

觀察可見(jiàn)，接種9 d后，暗培養(yǎng)的部分接種的葉柄兩端切口處有不同程度的膨大現(xiàn)象，13 d時(shí)切口膨大處裂開(kāi)，并長(zhǎng)出白色顆粒狀的愈傷組織。光培養(yǎng)的情況為：接種12 d后部分頂芽切口處出現(xiàn)膨大，15～16 d頂芽膨大處陸續(xù)長(zhǎng)出綠色顆粒狀的愈傷組織，以后愈傷組織數(shù)量逐漸增多并變大。由此可見(jiàn)，在暗培養(yǎng)條件下比光培養(yǎng)條件下先形成愈傷組織。30 d后計(jì)算愈傷組織鮮重增長(zhǎng)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可見(jiàn)，光培養(yǎng)的愈傷組織增長(zhǎng)量最小值和最大值分別為0.106 g和1.054 g，平均值為0.407 g；而暗培養(yǎng)分別為0.229 g和1.169 g，平均值為0.698 g。結(jié)果表明，暗培養(yǎng)對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)更加有利。因此，在對(duì)虎杖的外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，暗培養(yǎng)加快愈傷組織形成的速度，同時(shí)也更有利于其愈傷組織的生長(zhǎng)。

表3 光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)的愈傷組織鮮重增長(zhǎng)量對(duì)比

2.3 不同的激素水平對(duì)虎杖愈傷組織增殖的影響

2.3.1 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken設(shè)

計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，采用響應(yīng)面法對(duì)主要影響參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，采用Design Expert7.1.3 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與回歸分析。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，回歸分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 回歸分析結(jié)果

2.3.2 模型擬合 采用Design Expert7.1.3軟件，對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，選擇對(duì)響應(yīng)值顯著的各項(xiàng)，可得6-B A濃度、KT濃度、及2,4-D濃度與虎杖愈傷組織增殖率的二次多項(xiàng)回歸方程，回歸方程為：Y=-52.77194+30.1845X1+171.8825X2+374.5975X3-0.725X1X2+6.075X1X3+53.9375X2X3-8.64175X12-260.98125X22-424.35625X32?；貧w方程高度顯著（P<0.0001），相關(guān)系數(shù)R=99.98%，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有99.98%來(lái)源于所選變量。因此回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定三個(gè)參數(shù)的最佳水平。模型預(yù)測(cè)最大響應(yīng)值為97.91%。由分析結(jié)果可算出各因素的最佳取值：6-BA濃度為1.9 mg.L-1，KT濃度為0.4 mg.L-1，2,4-D濃度0.5 mg.L-1。

圖1 6-BA濃度與KT濃度對(duì)虎杖愈傷組織增殖率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖2 2,4-D濃度與6-BA濃度對(duì)虎杖愈傷組織增殖率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖3 2,4-D濃度與KT濃度對(duì)虎杖愈傷組織增殖率影響的響應(yīng)面及等高線圖

2.3.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化 響應(yīng)值對(duì)影響因素的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，可以直觀反映各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，見(jiàn)圖1～圖3。通過(guò)該組圖即可對(duì)任何兩因素交互影響虎杖愈傷組織增殖的效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，并從中確定最佳因素水平范圍。2.3.4 模型的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證虎杖愈傷組織增殖率模型方程的適用性，在選取6-BA濃度為1.9 mg.L-1，KT濃度為0.4 mg.L-1，2,4-D濃度0.5 mg.L-1的水平上，重復(fù)試驗(yàn)3次，得到虎杖愈傷組織增殖率達(dá)97.78%。與實(shí)測(cè)值吻合較好，說(shuō)明利用響應(yīng)面分析法得到的虎杖愈傷組織增殖工藝參數(shù)是真實(shí)可靠、具有實(shí)用價(jià)值的。

3 討論

采用現(xiàn)代生物技術(shù)開(kāi)展虎杖組織及細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)白藜蘆醇具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)高的優(yōu)勢(shì)，且不受地理環(huán)境及氣候等條件的影響，是解決原料資源不足的最佳途徑，而虎杖愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)于致密難以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，因此獲得疏松、增殖快的愈傷組織是實(shí)現(xiàn)虎杖細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的前提。本文采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，僅用較少的試驗(yàn)組合，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，明確了虎杖愈傷組織誘導(dǎo)的主要因素，同時(shí)優(yōu)化篩選了虎杖愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基和外植體，大大提高了試驗(yàn)效率。虎杖愈傷組織的形成和生長(zhǎng)是受多種因素影響的，而激素是影響愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的主要因素。目前，關(guān)于虎杖組織培養(yǎng)的研究的報(bào)道較少，曹庸等[8]通過(guò)比較虎杖不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)根莖芽的誘導(dǎo)率最高，為73%，而曾超珍等[9～10]研究發(fā)現(xiàn)虎杖葉柄的誘導(dǎo)率更高。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)葉片的誘導(dǎo)率最高，但其過(guò)于致密；其次為葉柄，誘導(dǎo)率可達(dá)92%，結(jié)合疏松誘導(dǎo)率、疏松程度及污染率等指標(biāo)綜合考慮，最終選擇葉柄作為虎杖愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體。從試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)不同的光照條件對(duì)虎杖愈傷組織的誘導(dǎo)率有一定的影響，并得知暗培養(yǎng)對(duì)愈傷組織的生產(chǎn)更加有利，可加快愈傷組織形成的速度，因此研究愈傷組織誘導(dǎo)率的影響因素要兼顧光照條件。有關(guān)蔗糖、pH、有機(jī)物、氮源等非激素因子對(duì)虎杖愈傷組織的影響及虎杖細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是后期研究的重點(diǎn)，該部分內(nèi)容將另文討論。

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