楊 陽，張運(yùn)津，謝 安，汪 泱，婁遠(yuǎn)蕾

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌外研究所，江西 南昌 330006；2、南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院；3、江西廣濟(jì)醫(yī)院)

miRNA 作為天然的基因調(diào)控因子在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、血管形成、腫瘤發(fā)生等許多重要病理生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]。大量研究表明差異表達(dá)的miRNA與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2-4]，有望成為其早期診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。雖然目前研究表明miRNA 參與糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)生發(fā)展，但都是基于動物模型和體外實驗，而臨床DN的相關(guān)研究目前鮮見報道。本文通過分析現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，選擇miRNA-93 進(jìn)行實時熒光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR) 檢測，分析其在糖尿病腎病患者血清和健康對照組血清的表達(dá)差異；探討其與DN 發(fā)生、發(fā)展等之間的關(guān)系，以明確其在DN 發(fā)生過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2010年8月—2011年3月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科確診為DN的患者為研究對象。收集其血清標(biāo)本共計20例。其中男性8例，女性12例；年齡33～76歲，平均52.8歲；DN 臨床分期：Ⅰ期-Ⅳ期(非尿毒癥組)12例，Ⅴ期(尿毒癥組)8例。對照組為20例健康體檢的正常血清。所有標(biāo)本-80℃保存。以上標(biāo)本收集均通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并簽署了知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 miRcute miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。其它常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。Tpersonal PCR 儀(德國Biometra)，實時定量PCR 儀step one plus(美國ABI)。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 檢測miRNA-93的表達(dá) 按miRcute miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒說明書操作。以U6為內(nèi)參，引物序列及PCR 產(chǎn)物片斷大小為：miRNA-93 上游CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG，下游引物為試劑盒提供的通用引物，擴(kuò)增產(chǎn)物為76bp；U6 上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下 游：AACGCTTCACGAATTTGCGT，擴(kuò)增產(chǎn)物為94bp。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

1.3.2 生物信息學(xué)預(yù)測miRNA-93 靶基因 采用targetScan (http://www.targetscan.org)、PicTar (http://picTar.mdc -berlin.de)、miRanda (http://microrna.sanger.ac.uk)、miRDB (http://miRNAdb.org/miRDB)4個軟件在線預(yù)測miRNA-93 靶基因。

1.3.3 統(tǒng)計學(xué)分析 以上實驗重復(fù)3 遍，實驗數(shù)據(jù)用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(P25,P75)]表示，采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。獨(dú)立樣本比較應(yīng)用非參數(shù)Mann-Whitney 檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DN組和健康對照組血清miRNA-93的表達(dá)情況 qRT-PCR顯示miRNA-93 在DN組的表達(dá)明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 兩組血清標(biāo)本miRNA-93表達(dá)比較

2.2 miRNA-93的表達(dá)與DN 臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 尿毒癥組患者血清miRNA-93表達(dá)水平明顯低于非尿毒癥組患者，差異有有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。不同的性別、年齡之間無差異。見表1。

表1 miRNA-93的表達(dá)與DN 臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

2.3 miRNA-93 靶基因預(yù)測 TargetScan 預(yù)測miRNA-93 靶基因為50個，PicTar 預(yù)測為613個，mi-Randa 預(yù)測為9156個，miRDB 預(yù)測為293個。預(yù)測的結(jié)果顯示miRNA-93 調(diào)節(jié)的靶基因范圍非常廣泛，涉及血管形成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等各個方面。其中6個基因與DN 相關(guān)：VEGFA、MTHFR、ADRA2B、SDC2、APOB、PPARG。

3 討論

DN 是導(dǎo)致糖尿病(DM)患者死亡的主要原因，也是尿毒癥的第二病因，因此DN 嚴(yán)重危害DM 患者的健康與生命，加重社會與家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。但是由于DN 起病隱匿，進(jìn)展緩慢，早期臨床癥狀不典型，而臨床一旦出現(xiàn)蛋白尿時，其進(jìn)程難以逆轉(zhuǎn)，大約7年內(nèi)有50%進(jìn)入尿毒癥期，最終發(fā)展為終末期腎病(ESRD)。因此，DN的早期診斷和治療就成為目前亟待解決的問題。miRNA 作為天然的基因調(diào)控因子在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、血管形成、腫瘤發(fā)生等許多重要病理生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]，有望成為許多疾病的早期診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

目前研究表明miRNA 參與DN的發(fā)生發(fā)展。Kato[5]研究組采用芯片、qRT-PCR、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)行體內(nèi)、體外實驗，結(jié)果表明在小鼠糖尿病動物模型和小鼠腎系膜細(xì)胞中miRNA-192表達(dá)上調(diào)；miRNA-192的靶基因為smad-l 作用蛋白(slPl)；slPl 是TGF-β-smad 通路的重要內(nèi)源性阻遏物，高表達(dá)的miRNA-192 通過對sIPl 抑制促進(jìn)TGF-β 介導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。該研究小組[6]也證實，在糖尿病腎病動物模型中，高表達(dá)的miRNA-216a 通過下調(diào)靶基因YB-1 蛋白(一個RNA 連接蛋白)調(diào)節(jié)TGF-β1的翻譯。TGFβl 是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的一個主要調(diào)控因子。Long[7]等研究表明miRNA-29c 在小鼠DN 模型的腎小球、高糖處理的足突細(xì)胞及微血管內(nèi)皮細(xì)胞中都有表達(dá)，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積累；并證實miRNA-29c的靶基因為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子Spry1,過表達(dá)的miRNA-29c 通過下調(diào)Spry1 促進(jìn)Rho 激酶的活化；敲除miRNA-29c 能減少動物模型的蛋白尿和細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白的積累。提示miRNA-29c 通過Spry1/Rho 通路促進(jìn)DN的進(jìn)展。使用同樣的技術(shù)方法，Long[8]還證實miRNA-93的靶基因是血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)。轉(zhuǎn)染miRNA-93 能抑制VEGFA 3’-UTR的轉(zhuǎn)錄和使高糖環(huán)境誘導(dǎo)的VEGFA 蛋白分泌減少；相反，使用miRNA-93 抑制劑后則使VEGFA的表達(dá)迅速增加。VEGFA 是一種二聚體糖蛋白，在血管生成、血管的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡和維持毛細(xì)血管軍完整性等方面具有重要作用，特別是在腎小球的形成和功能方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。在DN 動物模型腎臟中，VEGFA 是高表達(dá)的，干擾其表達(dá)后腎功能得到明顯改善。

已有的研究都是基于動物模型和體外實驗，對臨床DN的相關(guān)研究目前鮮見報道。本課題通過對現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的分析，利用qRT-PCR 方法檢測miRNA-93 在糖尿病腎病患者血清和健康對照組血清的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miRNA-93 在DN組的表達(dá)明顯低于健康對照組，尿毒癥組患者血清miRNA-93表達(dá)水平明顯低于非尿毒癥組患者，提示miRNA-93可能在在糖尿病腎病發(fā)生過程中起著重要作用。靶基因預(yù)測分析的結(jié)果顯示miRNA-93 調(diào)節(jié)的靶基因范圍非常廣泛，涉及血管形成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等各個方面。其中6個基因與DN 相關(guān)，分別是：VEGFA、亞甲基四氫葉酸還原酶 (MTHFR)、α-2B 腎上腺素受體(ADRA2B)、多配體聚糖2 (SDC2)、載脂蛋白B(APOB)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)。推測在DN 中，低表達(dá)的miRNA-93可能通過下調(diào)其靶基因來發(fā)揮作用，從而參與DN的發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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