李現(xiàn)杰，王忠民△，張明香

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院：1.心胸外科；2麻醉科，河南新鄉(xiāng)453100）

食管癌是上消化道最常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)為食管鱗狀上皮細胞癌（ESCC）。國內外近年研究結果表明，花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代謝異常參與腫瘤的發(fā)生。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）代謝通路是參與AA代謝的重要途徑，其關鍵酶是LOX，5－LOX是其同工酶中的一種，參與多種腫瘤的發(fā)生。但5－LOX在ESCC發(fā)生、發(fā)展中的作用和生物學意義尚不清楚。本文通過檢測5－LOX基因在ESCC中的表達情況，分析探討其與ESCC發(fā)生、發(fā)展的關系及其臨床生物學意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2011年5～9月本院心胸外科行食管癌根治術手術切除的新鮮ESCC組織標本53份（ESCC組）和部分病例相應的癌旁組織（距癌組織邊緣大于6cm）36份（對照組），所取組織標本均由2位病理學專家檢查確診。男39例，女14例；年齡43～72（59.0±7.80）歲，所有患者術前均未行化療和放療。主要試劑：TRIzol試劑、DNA Ladder購自生工生物工程（上海）有限公司；RT－PCR試劑盒購自寶生物（大連）工程有限公司；SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗人5－LOX單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。設計引物序列5－LOX上游：5′－CCC GGG GCA TGG AGA GCA－3′，下游：5′－GCG GTG GGG CAG CGT GTC－3′；β－actin 上 游：5′－CTA TTG GCA ACG AGC GGT TC－3′，下游：5′－CTT AGG AGT GGG GGT GGC－3′，擴增片段長度分別為416bp和776bp，均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2方法

1.2.1RT－PCR檢測5－LOX mRNA表達 取約100mg組織放入盛有液氮的研缽中研磨，加入1mL TRIzol液研磨成粉末，按照TRIzol RNA提取試劑盒操作說明步驟進行，將提取到的總mRNA溶解于40μL經DEPC處理過的去離子水中后－80℃冰箱保存?zhèn)溆茫?%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計分析判斷總RNA的完整性及含量和純度。嚴格按照RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒說明書配制反轉錄反應液，每份反應液加入1μL樣品DNA，混勻后在50℃條件下反應20min，95℃條件下5min，5℃條件下5min，進行1個循環(huán)。再向上述反應產物中加入PCR Buffer 10μL、特異下游引物0.5μL及 TaKaRa Ex Taq?HS 0.25μL，并用無菌蒸餾水補至40μL，混勻后用PE2400儀進行擴增反應。94℃預變性5min后，按以下反應條件進行30個循環(huán)：94℃→30s、59℃→30s、72℃→1min，最后72℃延伸7min，4℃條件下保存。以高壓處理后的DEPC水代替樣品mRNA的反應體系為空白對照，以β－actin引物代替5－LOX引物的反應體系為內對照。取上述PCR反應產物5μL在1%的瓊脂糖凝膠上，以110V，90mA條件下進行電泳約30min，結果經UVIpro紫外凝膠成像及分析系統(tǒng)觀察、掃描、拍照，分析圖片中5－LOX和β－actin的表達強度，并計算表達的相對系數(shù)（即5－LOX基因表達強度/β－actin的表達強度）。

1.2.2免疫組化SP法檢測5－LOX蛋白表達 將組織標本常規(guī)脫水、石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，脫蠟至水，再按照免疫組化SP試劑盒說明書進行免疫組化染色，一抗工作液濃度以1∶200稀釋，以0.1mol/L PBS代替一抗作陰性對照，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水透明后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察染色結果：以細胞核、核膜或細胞質中出現(xiàn)棕黃色細顆粒為陽性細胞。利用圖像分析軟件Image－Pro Plus 5.0分析結果，測定5－LOX蛋白表達的灰度值，每片隨機取5個高倍鏡視野，取其平均值記錄為5－LOX蛋白表達的灰度值。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對所記錄數(shù)據進行分析。采用s表示，計量資料使用t檢驗及單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

所有標本組織經RT－PCR產物電泳后，均可觀察到長度為776bp內參條帶。ESCC組組織中5－LOX mRNA的相對表達系數(shù)為0.389～0.982，平均為0.659±0.155，對照組相對表達系數(shù)為0.216～0.580，平均為0.382±0.108，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；ESCC組組織中5－LOX蛋白表達的灰度值為46.094～58.549，平均為51.853±3.793，對照組表達灰度值為31.535～43.535，平均為37.112±3.404，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。ESCC組織中5－LOX mRNA表達水平在高分化組明顯低于中、低分化組，臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期的病例明顯高于分期為Ⅰ、Ⅱ期的病例（P＜0.05），此外其表達水平還與腫瘤的淋巴轉移及外膜的浸潤有關（P＜0.05）；5－LOX蛋白表達水平也與腫瘤的外膜浸潤、分化程度、有無淋巴結轉移及臨床分期有關（P＜0.05），見表2。

表1 5－LOX在兩組標本組織中的表達比較（s）

表1 5－LOX在兩組標本組織中的表達比較（s）

53 0.659±0.155 51.853±3.793對照組 36 0.382±0.108 37.112±3.404 t 9.886 19.138 P 5－LOX蛋白表達灰度值ESCC組組別 n 5－LOX mRNA相對表達系數(shù)0.000 0.000

表2 ESCC病理特征與5－LOX表達情況（s）

表2 ESCC病理特征與5－LOX表達情況（s）

臨床特征 n 5－LOX mRNA相對表達系數(shù) P 5－LOX蛋白表達灰度值P外膜浸潤有25 0.715±0.156 0.011 53.255±3.655 0.010無28 0.608±0.139 50.602±3.520分化程度高分化 19 0.562±0.138 0.000 49.525±3.390 0.000中分化 23 0.677±0.122 52.316±3.333低分化 11 0.786±0.148 54.907±2.937淋巴轉移有19 0.731±0.173 0.010 53.509±4.024 0.016無34 0.618±0.131 50.928±3.372臨床分期Ⅰ期 1 0.416±0.000 0.014 46.325±0.000 0.036Ⅱ期 26 0.628±0.130 51.202±3.424Ⅲ期 24 0.679±0.159 52.285±3.818Ⅳ期

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，AA代謝異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關［1－4］，AA主要通過環(huán)氧合酶途徑、LOX途徑及細胞色素P450途徑代謝，產生前列腺素類（PGs）、血栓素 A2（TXA2）、羥二十碳四烯酸（HETEs）和白細胞三烯（LTs）以及環(huán)氧化二十碳三烯酸（EETs）等代謝產物，統(tǒng)稱為類花生酸。這些產物與腫瘤的發(fā)生、增殖、轉移和凋亡等生物學活性行為密切相關［5－6］。

5－LOX基因定位于第10號染色體p11.2亞帶，隨合成該酶的白細胞不同其編碼的蛋白相對分子質量為（72～80）×103，5－LOX代謝通路異常可促進多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，這一作用已在許多腫瘤組織如胃癌、胰腺癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌和乳腺癌等中證實。5－LOX高表達能夠促進細胞的惡性增殖、阻止其凋亡，同時可以促進腫瘤血管的形成，增強其轉移的能力，提高侵襲力。相關研究發(fā)現(xiàn)，給予5－LOX特異性抑制劑后可以顯著抑制腫瘤細胞的增殖［7－8］。

Hoque等［9］采用免疫組化等技術對食管癌的研究發(fā)現(xiàn)，5－LOX蛋白在食管癌組織中表達水平上調，而且其表達水平與腫瘤的分化程度及淋巴結轉移密切相關。本文聯(lián)合采用RT－PCR及免疫組化技術發(fā)現(xiàn)在ESCC組織和癌旁正常食管組織中均有5－LOX表達，ESCC組織中（其mRNA的相對表達系數(shù)平均為0.659±0.155，5－LOX 蛋白表達的灰度值平均為51.853±3.793）呈高表達，與對照組（mRNA的相對表達系數(shù)平均為0.382±0.108，蛋白表達的灰度值平均為37.112±3.404）比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而且腫瘤分化程度越差其表達水平越高，5－LOX不僅調劑正常食管組織的生長，而且在ESCC的發(fā)生中起著更為重要的作用。結合臨床主要相關參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)5－LOX在腫瘤臨床分期低的較分期高的表達程度要高，出現(xiàn)外膜浸潤及淋巴結轉移時其表達水平亦偏高，提示5－LOX的高表達能夠提高食管癌的轉移能力并增強其侵襲力。淋巴結轉移可作為影響腫瘤預后的獨立因素，5－LOX的高表達提示食管癌的患者預后不良。

本研究提示5－LOX可能在ESCC的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，對食管癌的臨床診治提供了新的方法和實驗室依據。近年來利用5－LOX特異性抑制劑治療腫瘤的研究已成為熱點，并有望能夠成為治療ESCC的新途徑。

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