詹園鳳，鄭鋒，黨選民

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南儋州，571737）

人工誘導(dǎo)的多倍體作物具有一定優(yōu)勢(shì)，如品質(zhì)更優(yōu)、抗性增強(qiáng)等，但也伴隨著稔性降低等諸多問(wèn)題[1，2]。對(duì)小型西瓜四倍體育種研究發(fā)現(xiàn)，同源四倍體西瓜與二倍體相比，稔性明顯下降，有的四倍體西瓜甚至沒(méi)有正常發(fā)育的種子，嚴(yán)重影響四倍體西瓜的育種效率。而有關(guān)四倍體西瓜稔性低的原因，在細(xì)胞遺傳學(xué)、生理學(xué)等方面進(jìn)行了部分研究[3～6]。本研究旨在對(duì)二倍體與同源四倍體西瓜受精前后生殖特性進(jìn)行比較研究，探討四倍體西瓜低稔性的原因，為提高四倍體西瓜結(jié)籽率提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所選育的二倍體高代自交系049（2X）和用Oryazalin誘變的四倍體049（4X）。

1.2 試驗(yàn)方法

①田間試驗(yàn)與樣品采集 試驗(yàn)于2010年5月開(kāi)始在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院冬季瓜菜研究中心試驗(yàn)基地大棚內(nèi)進(jìn)行。催芽后播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，待幼苗長(zhǎng)至2～3片真葉時(shí)移栽，按常規(guī)方法管理。開(kāi)花期，每天下午將雌花和雄花套袋隔離，次日上午自交授粉，授粉后繼續(xù)套袋隔離，并掛牌標(biāo)記。授粉后0.5，1，2，3，4，5，7，9，12 h 摘取不同倍性雌蕊各 5枚； 授粉后 8，12，16，20，24，30，36，42，48，72 h 摘取不同倍性子房各 5 枚；授粉后 4，5，6，7，8，9，10，12，14，16 d取不同倍性子房的胚珠各20粒，所取材料均用FAA固定液保存?zhèn)溆谩?/p>

②花粉管生長(zhǎng)觀察 采用熒光染色法觀察花粉管生長(zhǎng)。雌蕊材料從FAA固定液中取出，依次經(jīng)過(guò) 70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）酒精（2 次）、50%酒精、30%酒精、蒸餾水浸泡，每次30 min；將材料放入5 mol/L的NaOH溶液中室溫下軟化10 min；蒸餾水洗3次；用鑷子剝?nèi)≈^，將柱頭放入苯胺藍(lán)溶液中染色10 min以上；將材料置于載玻片上，滴加1滴染色液，蓋上蓋玻片并輕壓，在熒光顯微鏡下觀察并照相。

③胚胎發(fā)育觀察 采用石蠟切片法觀察胚的發(fā)育。子房及胚珠采用愛(ài)氏蘇木精整體染色法制作石蠟切片[7]，切片厚度為 8 μm；Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同倍性花粉粒萌發(fā)的觀察比較

不同倍性花粉粒在雌蕊柱頭上的萌發(fā)率不同（圖1）。授粉0.5 h后，二倍體與四倍體花粉粒均開(kāi)始萌發(fā)，但四倍體花粉萌發(fā)數(shù)量明顯少于二倍體；授粉2 h后，二倍體與四倍體花粉的萌發(fā)率均達(dá)到最高，二倍體的花粉萌發(fā)率為96.3%，而四倍體的花粉萌發(fā)率僅為63.7%。熒光染色觀察表明，二倍體花粉粒形態(tài)整齊一致，在柱頭上分散性好，萌發(fā)率較高（圖3-1）；四倍體花粉粒大小不一，部分花粉粒畸形失去生活力，因而萌發(fā)率較低（圖3-2）。

2.2 不同倍性花粉管在花柱中的生長(zhǎng)

二倍體花粉管生長(zhǎng)速度快，花粉管粗細(xì)均勻，生長(zhǎng)整齊一致 （圖3-3）。四倍體花粉管粗細(xì)不均勻，在生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生扭曲、折疊、盤(pán)繞、頂端膨大等異?，F(xiàn)象（圖3-4）。二倍體花粉粒萌發(fā)時(shí)只產(chǎn)生一根花粉管，但四倍體花粉粒萌發(fā)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)一萌發(fā)孔雙花粉管（圖3-5）、二萌發(fā)孔雙花粉管（圖3-6）和三花粉管等多花粉管現(xiàn)象（圖3-7）。

觀察結(jié)果 （圖2）表明，二倍體與四倍體花粉管在花柱內(nèi)每個(gè)時(shí)間段的生長(zhǎng)速度并不一致。從萌發(fā)開(kāi)始花粉管的生長(zhǎng)速度不斷加快；在授粉后5 h，二倍體與四倍體花粉管的生長(zhǎng)速度最快，二倍體速度為1.293 mm/h，四倍體速度為1.088 mm/h，之后花粉管的生長(zhǎng)速度又開(kāi)始下降。大約在授粉后9 h，二倍體花粉管到達(dá)花柱的基部（圖3-8），開(kāi)始進(jìn)入子房；而四倍體花粉管在授粉后12 h才到達(dá)花柱基部（圖3-9），生長(zhǎng)速度相比二倍體明顯要慢得多。

2.3 不同倍性西瓜胚胎的發(fā)育

西瓜子房?jī)?nèi)著生多個(gè)倒生胚珠，胚珠中心為珠心，內(nèi)含有胚囊，整個(gè)胚囊為珠心細(xì)胞所包圍（圖3-10）。成熟的西瓜胚囊為寥型胚囊，8核、7細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)卵細(xì)胞、2個(gè)助細(xì)胞、2個(gè)中央細(xì)胞核（極核）和3個(gè)反足細(xì)胞。胚囊完成雙受精后，形成合子與初生胚乳核，而初生胚乳核不休眠、分裂形成胚乳游離核，前期胚乳游離核數(shù)量很少，游離在胚囊周?chē)▓D3-11）。合子經(jīng)過(guò)短暫休眠后開(kāi)始分裂，形成基細(xì)胞和頂細(xì)胞的2細(xì)胞原胚，頂細(xì)胞經(jīng)多次分裂形成多細(xì)胞原胚（圖3-12），之后原胚快速發(fā)育成球胚（圖3-13），而胚乳游離核則在球胚前期開(kāi)始由珠孔端向合點(diǎn)端靠近，并與游離在胚囊周?chē)呐呷橛坞x核一起快速形成一管狀的胚乳吸器（圖3-14），胚乳吸器頂端插入珠心細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，到球形胚晚期胚乳吸器開(kāi)始細(xì)胞化。球形胚晚期遠(yuǎn)離孔端的細(xì)胞分裂加快，靠近珠孔端的細(xì)胞分裂速度稍慢，胚體發(fā)育成上窄下寬的梨形胚（圖3-15）；而胚乳游離核則細(xì)胞化并包圍在梨形胚周?chē)?；梨形胚繼續(xù)分裂，開(kāi)始形成子葉原基，胚體發(fā)育形成心形胚（圖3-17），心形胚迅速演化為魚(yú)雷胚（圖3-17），之后細(xì)胞化的胚乳吸器開(kāi)始解體，退化成不規(guī)則的條狀，發(fā)育形成子葉胚（圖3-18），而胚乳則完全解體被子葉吸收。

圖1 不同倍性花粉粒萌發(fā)率的比較

圖2 不同倍性花粉管生長(zhǎng)的比較

二倍體西瓜授粉約16 h后開(kāi)始受精，經(jīng)過(guò)2～4 h完成雙受精過(guò)程。授粉后48 h合子開(kāi)始細(xì)胞分裂形成多細(xì)胞原胚；至第3天，原胚發(fā)育形成小球胚，隨后小球胚發(fā)育成大球胚；至第5天，形成梨形胚；至第6天，胚體發(fā)育形成心形胚；至第7天，心形胚迅速演化為魚(yú)雷胚。至第9天，魚(yú)雷胚發(fā)育形成子葉胚，最后形成成熟的胚。

四倍體與二倍體受精過(guò)程、胚胎與胚乳的發(fā)育幾乎相同，只是受精的時(shí)間較晚，胚胎發(fā)育時(shí)間長(zhǎng)些，四倍體西瓜授粉42 h后花粉管進(jìn)入胚囊，4～6 h完成雙受精過(guò)程；四倍體原胚期較二倍體時(shí)間長(zhǎng)，且有部分胚囊敗育（圖3-19），至第6天才形成小球形胚，第8天形成梨形胚，第9天發(fā)育成心形胚，隨后快速發(fā)育成魚(yú)雷胚，最終形成子葉胚。四倍體胚胎在發(fā)育的過(guò)程中，因原胚期、球胚期、心形胚期或魚(yú)雷胚期，胚乳細(xì)胞過(guò)早地解體，而不能夠?yàn)榕唧w提供營(yíng)養(yǎng)，致使胚體退化（圖3-19，20），最終敗育，形成沒(méi)有種仁的空種子。

3 結(jié)論與討論

3.1 四倍體花粉粒萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)與雌蕊的關(guān)系

被子植物雙受精過(guò)程中具有多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，主要可分為花粉與柱頭、花粉管與花柱以及雌雄配子之間3個(gè)部位，任何一個(gè)部位不能正確識(shí)別都有可能產(chǎn)生生殖障礙，導(dǎo)致敗育[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，小型四倍體西瓜花粉活力下降，在柱頭上的萌發(fā)率較低，僅為63.7%；花粉管在柱頭內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，且花粉管發(fā)生扭曲、折疊、盤(pán)繞、頂端膨大、出現(xiàn)多花粉管等異?，F(xiàn)象，可見(jiàn)花粉在柱頭上的萌發(fā)以及花粉管的伸長(zhǎng)等都受到了不同程度的抑制，導(dǎo)致進(jìn)入胚囊的花粉管數(shù)量減少，雙受精成功率較低，這可能是造成四倍體低稔性的重要原因。譚素英等[4]在研究多倍體西瓜花粉萌發(fā)生長(zhǎng)與內(nèi)源激素的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，花粉粒萌發(fā)率低，花粉管在花柱中生長(zhǎng)緩慢，與花粉中玉米素核苷（ZR）含量過(guò)高、雌蕊的生長(zhǎng)素（IAA）和赤霉素（GA3）與脫落酸（ABA）的比值低、及花粉和雌蕊共同作用有關(guān)。

圖3

3.2 四倍體西瓜胚胎敗育與胚乳的關(guān)系

西瓜胚的發(fā)育屬于紫菀型，胚乳的發(fā)育屬于核型。西瓜胚囊在雙受精后，胚乳先于合子發(fā)育，為幼胚的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而胚乳的敗育會(huì)導(dǎo)致胚的敗育。薛志強(qiáng)等[6]對(duì)少籽西瓜材料內(nèi)源激素含量變化與胚胎敗育關(guān)系研究結(jié)果表明，內(nèi)源激素的相對(duì)虧損可能對(duì)胚敗育起了重要作用，少籽西瓜在球形胚時(shí)期，IAA、GA3和異戊烯腺苷（iPAs）的相對(duì)虧損達(dá)30%～70%，而ABA則相對(duì)富足，內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化及它們之間的比例平衡與西瓜胚胎敗育有著密切聯(lián)系。譚素英等[3，4]、謝興剛[5]的研究結(jié)果表明，四倍體西瓜在胚發(fā)育過(guò)程中，因胚乳游離核異常解體或胚乳細(xì)胞過(guò)早的解體，導(dǎo)致在原胚、球形胚、心形胚或魚(yú)雷胚階段退化敗育，最后只有少數(shù)的胚與胚乳發(fā)育正常形成有活力的成熟種子。這與本研究結(jié)果相似，但本研究的小型西瓜胚胎發(fā)育的時(shí)間較早，發(fā)育速度快，這可能是由于本試驗(yàn)小型西瓜為早熟品種，加上海南的夏季高溫影響果實(shí)內(nèi)源激素及養(yǎng)分的積累而導(dǎo)致果實(shí)生育期縮短，相關(guān)影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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