張艷紅，孫麗建，李 強(qiáng)，趙冬梅，王清文

（1.東北林業(yè)大學(xué) 生物質(zhì)材料科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2.黑龍江大學(xué) 化學(xué)化工與材料學(xué)院，哈爾濱 150080；3.黑龍江東方學(xué)院 食品與環(huán)境工程學(xué)部，哈爾濱 150086）

酮康唑（Ketoconazole）是一種咪唑類廣譜抗真菌藥，通過抑制霉菌細(xì)胞膜中麥角甾醇的生物合成達(dá)到抗真菌的作用[1]。隨著近年來真菌病的發(fā)病率迅猛增長(zhǎng)，越來越多的科研機(jī)構(gòu)致力于酮康唑的研究及開發(fā)[2]。目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中測(cè)定酮康唑所采用的HPLC法多用于粉劑、片劑、霜?jiǎng)┮约吧矬w液中酮康唑的檢測(cè)，但對(duì)于載藥微球緩慢釋放溶出液中酮康唑的含量測(cè)定，尚未見報(bào)道。本文建立了一種適用于測(cè)定微球中酮康唑含量的高效液相色譜（HPLC）測(cè)定法。

1 儀器與試劑

島津LC-10AT高效液相色譜儀，配有SPD-10A型檢測(cè)器。甲醇（色譜純），三乙胺（分析純），磷酸（優(yōu)級(jí)純），水（雙蒸餾水），酮康唑?qū)φ掌罚ê焙愦T化工有限公司），酮康唑緩釋微球（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 酮康唑緩釋微球的制備

將乳酸－羥基乙酸共聚物（PLGA）溶于混合溶劑（苯／1，2-二氯乙烷＝17／10）中，再加入酮康唑，使其溶解成作為分散相的均一透明溶液，采用微流控裝置，將分散相滴入8%聚乙烯醇水溶液中制備載藥微球。將分離干燥后的微球裝入密封袋中保存。圖1是放大40倍的顯微鏡下觀察到的不同分散相流速下的PLGA載藥微球的照片，通過調(diào)整微流控裝置中分散相的流速即可得到不同粒徑的微球。圖2是在放大40倍的顯微鏡下觀察到的微球照片，所得微球表面光滑，粒徑較均一。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取一定量微球樣品置于燒杯中，加入一定量的苯使微球溶解，將溶解后的溶液置于分液漏斗中，加入一定量的甲醇溶液萃取，連續(xù)萃取3次，合并萃取液并定容，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為 ODS C18（250mm×4.6mm，5μm，迪馬公司），流動(dòng)相為甲醇：磷酸緩沖鹽＝80／20（磷酸緩沖鹽：0.34mL磷酸與200mL雙蒸餾水混合，用三乙胺調(diào)節(jié)pH＝3.0），檢測(cè)波長(zhǎng)為242nm，流量為0.80mL／min，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為20μL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取一定量80℃減壓干燥至恒重的酮康唑?qū)φ掌罚昧鲃?dòng)相配制成濃度分別為1.0、2.5、5.0、10、15、20、30μg／mL的對(duì)照品溶液，各進(jìn)樣20μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以酮康唑濃度（C）對(duì)峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝27298 X＋159.39（r＝0.9999）。該結(jié)果表明酮康唑在1.0～30.0μg／mL線性關(guān)系良好。

最低檢出限確定：取不同濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)行色譜分析，當(dāng)主峰峰高為噪音峰高3倍時(shí)的濃度即為儀器的最低檢出限，酮康唑的最低檢出限為10.8ng／mL。

2.5 專屬性試驗(yàn)[1]

在2.3色譜條件下，分別對(duì)供試樣溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液（不含酮康唑的微球處理液）進(jìn)行色譜分析，色譜圖見圖3?？梢姽┰嚻放c對(duì)照品溶液的色譜圖分別在保留時(shí)間（tR）5.89 min和5.63min處出現(xiàn)單一酮康唑吸收峰，陰性對(duì)照品溶液色譜圖在tR＝5.89min附近沒出現(xiàn)任何吸收峰，表明專屬性好。理論塔板數(shù)按酮康唑峰計(jì)算應(yīng)≥2000。

圖3 色譜圖Fig.3 Chromatograms

2.6 精密度試驗(yàn)（重復(fù)性）

取6份同一批次制備的緩釋微球，按2.2方法將藥物萃取并定容，制成濃度約為2.50μg／mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)行色譜分析，計(jì)算實(shí)際測(cè)得的濃度，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)（重復(fù)性）結(jié)果Table1 Precision experiment（repeatability）

2.7 回收率試驗(yàn)

取3份空白微球置于燒杯中，分別精密加入一定量的酮康唑，按2.2方法進(jìn)行萃取、定容、進(jìn)行色譜分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)（n＝3）Table2 Recovery rate test（n＝3）

2.8 微球樣品中酮康唑含量的測(cè)定

按2.2方法制備供試品溶液，按2.3中的色譜條件進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖，按照工作曲線法計(jì)算樣品中酮康唑含量。載藥量為20%的PLGA微球中酮康唑的釋放曲線見圖4。

圖4 載藥量為20%的PLGA微球的釋藥曲線Fig.4 Release profile of 20%drug-loaded PLGA microspheres

3 結(jié) 論

藥典中HPLC法測(cè)定酮康唑制劑含量的流動(dòng)相為0.2%的二異丙胺的甲醇溶液和0.5%的醋酸銨溶液（77／23）[3]。但在實(shí)際測(cè)定時(shí)，出峰時(shí)間較長(zhǎng)約7 min，且峰形不好。其他文獻(xiàn)中流動(dòng)相多為70%～90% 甲醇[4－6]。本文采用甲醇／緩沖鹽（80／20）時(shí)，由于加入三乙胺掃尾劑，可以改善色譜峰形，得到的是較為尖銳、對(duì)稱的峰形。該方法保留時(shí)間僅為5.89min，因此該方法優(yōu)于藥典中的方法。

實(shí)驗(yàn)表明，HPLC法分離效率高、速度快，流動(dòng)相可選擇范圍寬、靈敏度高、色譜柱可反復(fù)使用，適用于酮康唑微球中酮康唑含量的測(cè)定。

[1]徐蘭琴，黃 雁.高效液相色譜法直接測(cè)定酮康唑含量[J].廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，25（4）：84-86.

[2]杜繼紅，王婭芳，周艷飛，等.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方酮康唑溶液中酮康唑的含量 [J].中國(guó)動(dòng)物保健，2009，（1）：103-104.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：1066.

[4]葉杰勝，孫 莉.HPLC法測(cè)定復(fù)方酮康唑軟膏中酮康唑含量的不確定度評(píng)定 [J].安徽醫(yī)藥.2011，15（10）：1216-1218.

[5]田隨安，張向兵，李永利.消毒洗劑中酮康唑的高效液相色譜測(cè)定法 [J].環(huán)境與健康雜志，2007，24（10）：809-810.

[6]倪 華，范義鳳.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方酮康唑凝膠中酮康唑的含量 [J].交通醫(yī)學(xué)，2008，22（3）：317-318.