余 琦，李 寧，宋業(yè)穎，李彩云，楊江輝 (解放軍第309醫(yī)院病理科，北京 100091)

結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis)引起的結(jié)核病為世界三大傳染病之一［1］。近年來，我國結(jié)核病發(fā)病率持續(xù)上升，肺結(jié)核患病人數(shù)居全球第二位，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率在我國27種法定傳染病中均占據(jù)首位。傳統(tǒng)的結(jié)核桿菌檢測法如細菌培養(yǎng)法、抗酸染色法等檢測時間周期較長，或陽性率低，漏檢率較高。為了克服以往檢測方法的固有缺陷，需要發(fā)展敏感性高、特異性強的結(jié)核桿菌快速檢測技術(shù)［2］。隨著分子生物學技術(shù)的成熟發(fā)展，熒光定量PCR(FQPCR)技術(shù)已被廣泛應用于各種臨床病原體的檢測。本文采用FQ-PCR檢測法對石蠟包埋病理組織中的結(jié)核分枝桿菌DNA(TB-DNA)進行檢測，并與抗酸染色和組織病理形態(tài)學檢查進行比較，評價其在結(jié)核分枝桿菌檢測中的臨床應用價值［3］。

1 資料與方法

1.1 標本來源

2011年2月至2012年2月期間我院臨床診斷肺結(jié)核的病理組織石蠟包埋標本196例，其中肺穿刺活檢組織標本62例，胸膜活檢組織標本60例，淋巴結(jié)穿刺活檢標本30例，支氣管活檢組織標本46例。

1.2 主要試劑與儀器

TB-DNA探針及引物試劑盒(北京新基永康基因科技有限公司提供)，SLAN全自動熒光定量PCR檢測儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司提供)，苯酚品紅染液，4%NaOH溶液。

1.3 PCR 檢測方法

將蠟塊組織切取5μm薄片裝入EP管中，每切取1例標本之后，即采用0.3%次氯酸鈉消毒液清潔刀口及周圍部分，防止污染，將EP管中加入220μl buffer TL，90℃ 1 h。室溫放置1 min，12000 r/min離心2 min，小心穿過石蠟層，吸取200μl液體(包含組織)轉(zhuǎn)至新的1.5 mL EP管，加入20μl OB蛋白酶，簡短離心，收集管蓋上液體。55℃水浴2 h，以組織基本都消化為準;中間每隔20 min混勻1次;室溫12000 r/min離心2 min，轉(zhuǎn)移上清至新的1.5 mL離心管，加入220μl buffer BL和4μl linear acrylamide，顛倒混勻，簡短離心，收集管蓋上液體，70℃水浴10 min。加入220μl無水乙醇，顛倒充分混勻;轉(zhuǎn)移混合液至HiBind柱中，放置1 min;室溫8000 r/min離心30 s，棄去濾液;加入500μl HB buffer，放置1 min;室溫8000 r/min離心30 s，棄去濾液;加入 500 μl DNA washing buffer，放置1 min;室溫8000 r/min離心30 s，棄去濾液;室溫12000 r/min離心2 min，以盡量去除DNA吸附膜上的乙醇;將柱子裝到新的無菌1.5 mL EP中，加入70℃預熱的Elution buffer 50μl，室溫靜置2 min，12000 r/min離心2 min;將提取好的組織DNA與配制好的PCR擴增試劑混勻，按順序置于PCR儀上，編輯樣本信息，設(shè)定循環(huán)參數(shù)。

1.4 抗酸染色檢測方法

石蠟包埋組織3μm切片，常規(guī)二甲苯脫蠟入水。將配制好的苯酚品紅溶液滴加在組織切片上，放入濕盒，常溫下染色10 min。切片入流水沖洗3 min，常規(guī)酒精脫水，中性樹膠封片。

1.5 病理組織學檢測

以病理最終診斷報告中出現(xiàn)“符合結(jié)核病變”作為陽性結(jié)果判定標準，否則判定為陰性結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，定性資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差別具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

在196例臨床診斷結(jié)核陽性樣本中，應用FQ-PCR法(圖1)、抗酸染色法(圖2)和組織病理學檢測的陽性率分別為69.39%、35.20% 和 52.04%，三者陽性率比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表1。不同部位組織在不同檢測方法中的陽性例數(shù)見表2。

表1 三種方法對196例陽性樣本的檢測情況

表2 三種方法檢測不同部位組織的陽性例數(shù)(n)

圖1 熒光定量PCR(熔解曲線法)檢測結(jié)果

圖2 支氣管結(jié)核干酪樣壞死中陽性桿菌(抗酸染色 ×400)

3 討論

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種慢性傳染病，已成為全球性公共衛(wèi)生問題［4］。臨床診斷工作中通常需要病理診斷來確定病變是否為結(jié)核分枝桿菌感染，從而確定治療方案。抗酸染色檢測法的優(yōu)點是簡便、快速、價廉，缺點是特異性差，不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌［5］，容易造成漏診和誤診。傳統(tǒng)組織病理學依據(jù)組織形態(tài)學改變，如肉芽腫病變、壞死的特點等，在缺乏典型的組織形態(tài)特點時往往難以確診，不能及時有效地為臨床治療提供有利的診斷依據(jù)。PCR方法已廣泛應用于微生物檢測和研究［6］。近年出現(xiàn)的FQ-PCR技術(shù)，是將實時熒光監(jiān)測與普通PCR技術(shù)相結(jié)合，能夠?qū)δ繕宋⑸镞M行實時定量檢測，已被成功用于微生物快速定量檢測［7-8］。本研究采用分枝桿菌菌種DNA探針鑒定產(chǎn)品，檢測試劑以Real-time PCR儀為平臺，利用不對稱PCR擴增技術(shù)，通過分析比較特異的熒光標記寡核苷酸探針同與其完全互補單鏈PCR產(chǎn)物(結(jié)核分枝桿菌)以及存在錯配的單鏈PCR產(chǎn)物(非結(jié)核分枝桿菌)結(jié)合所產(chǎn)生熔解曲線Tm值的變化，來檢測標本中是否存在分枝桿菌感染，并區(qū)分結(jié)核分枝桿菌(復合群)與非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。當發(fā)生NTM感染時，其熔解曲線峰所示的Tm值與結(jié)核分枝桿菌相比會有所降低。該方法將TagMan探針技術(shù)和實時熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合，即能鑒定是否有分枝桿菌感染，還能對菌株進行分型。按照結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的特異性序列設(shè)計引物和探針，分別標記不同的熒光。當反應體系中有目的基因存在時，隨著PCR反應的進行，就會釋放出熒光，通過實時監(jiān)測不同通道的熒光信號，可以進行結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌兩者的區(qū)分鑒定。具有檢測速度快，靈敏度高，準確度高的特性。本研究還比對了不同部位組織中用不同方法的陽性檢出率，F(xiàn)Q-PCR檢測法的陽性檢出率均高于其他檢測方法，這說明了熒光探針雜交檢測具有較高的特異性［9］，在李秀斌等［10］報道中病理診斷為結(jié)核者石蠟包埋組織TB-DNA陽性率為93.14%，也支持了本研究的觀點。

綜上所述，F(xiàn)Q-PCR檢測石蠟切片組織標本的TBDNA，具有簡便、靈敏、特異的優(yōu)點，與病理學檢查相結(jié)合，可進一步提高病理組織中結(jié)核分枝桿菌感染診斷的準確度和特異性，適合臨床檢驗和實驗室應用，在結(jié)核病的早期診斷上具有臨床實用價值［11］。

［1］ Maartens G，Wilkinson RJ.Tuberculosis［J］.Lancet，2007，370(9604):2030－2043.

［2］ Lima SS，Clemente WT，Palaci M，et al.Conventional and molecular techniques in the diagnosis of pulmonary tuberculosis:a comparative study［J］.J Bras Pneumol，2008，34(12):1056 －1062.

［3］ Davies PDO，Pai M.結(jié)核病的診斷與誤診［J］.國際結(jié)核病與肺部疾病雜志(中文版)，2009，4(1):38 －46.

［4］ Ma Z，Lienhardt C，Mcllleron H，et al.Global tuberculosis drug development pipeline:the need and the reality［J］.Lancet，2010，375(9731):2100－2109.

［5］ 譚 笑.結(jié)核病實驗室快速診斷方法的研究［J］.湖南師范大學學報(醫(yī)學版)，2007，4(2):58-59.

［6］ 萬穎杰，張俊磊，安 靜.細胞培養(yǎng)中細菌類微生物污染的快速檢測［J］.局解手術(shù)學雜志，2005，14(2):88 －90.

［7］ Harris KA，Turner P，Green EA，et al.Duplex real-time PCR assay for detection of streptococcus pneumoniae in clinical samples and determination of penicillin susceptibility［J］.J Clin Microbiol，2008，46(8):2751－2758.

［8］ Espy MJ，Uhl JR，Sloan LM，et al.Real-time PCR in clinical microbiology:applications for routine laboratory testing［J］.Clin Microbiol Rev，2006，19(1):165 －256.

［9］ 李國利.實時熒光定量PCR技術(shù)在結(jié)核病診斷實驗室的研究和應用［J］.臨床肺科雜志，2008，13(10):1315-1317.

［10］ 李秀斌，李幸彬，杜秀然，等.石蠟包埋組織實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測在結(jié)核病診斷中的價值［J］.中國防澇雜志，2010，32(5):272－275.

［11］ 韓紀勤.熒光定量聚合酶鏈反應診斷結(jié)核病臨床應用研究［J］.山西醫(yī)科大學學報，2006，37(2):180 －181.