李祥炎，陳建梅，崔曉萍，徐 皓 (.三明市第一醫(yī)院骨科，福建 三明 365000;2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院a:骨科，b:神經(jīng)內(nèi)科，福建福州 350025)

脊髓損傷后經(jīng)過一系列復(fù)雜的病理生理改變會引起脊髓組織內(nèi)神經(jīng)細胞發(fā)生不可逆死亡，最終導(dǎo)致癱瘓。目前對其病理機制的研究還未完全闡明，建立合適的動物模型是開展研究重要前提。然而，現(xiàn)有的動物模型無法滿足急性脊髓擠壓等多種損傷類型的研究需要。本實驗根據(jù)臨床損傷特點，利用動脈瘤夾鉗夾SD大鼠T10脊髓，以建立一種與臨床脊髓損傷機制相接近的動物模型，從而為進一步探討脊髓損傷后的修復(fù)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，體質(zhì)量(262.3±5.6)g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司［合格證號:SCXK(滬)2007－0005］，常規(guī)飼養(yǎng)1周后開始進行實驗。將大鼠隨機分成3組，每組12只。脊髓損傷組(A組):用動脈瘤夾鉗夾大鼠T10脊髓;假手術(shù)組(B組):只打開椎板，暴露T10脊髓，不造成SCI;正常對照組(C組):不進行任何手術(shù)操作。術(shù)前所有實驗動物雙后肢BBB評分均為21分。

1.2 方法

1.2.1 脊髓損傷的制備 A組:將大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100g)腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺上。常規(guī)消毒鋪單，以T10棘突為中心行后背正中切口，長約3 cm。逐層切開皮膚、皮下組織，剝離豎棘肌并向兩側(cè)牽開，顯露T9～T11棘突及椎板，切斷T10～T11棘間韌帶，并去除T11部分棘突，用有齒鑷夾持T10棘突并稍向上提起，使T10～T11關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)分離，小心咬除T11上關(guān)節(jié)突外側(cè)緣部分骨質(zhì)，使T10下關(guān)節(jié)突下緣出現(xiàn)空隙，以此為突破口向上咬除T10椎板，使T10脊髓充分暴露，可見脊髓背側(cè)正中有一粗大靜脈。然后用動脈瘤夾夾持脊髓至其直徑的1/2，時間30 s?？梢姶笫蠹顾韬笳械撵o脈變細，尾巴逐漸卷曲翹起，雙后肢出現(xiàn)抽搐，隨后雙后肢及尾巴松弛癱軟。用生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合。術(shù)后每日觀察雙后肢及尾巴活動情況，并予以人工膀胱擠尿2～3次，雙后肢被動屈伸活動及按摩2～3次，并保持毛發(fā)干燥。B組:暴露T10脊髓后不進行鉗夾，生理鹽水沖洗傷口后縫合，其他處理同A組。C組:麻醉后不進行手術(shù)處理。

1.2.2 行為學(xué)評分 在損傷后第1周、第2周、第3周、第4周，分別采用雙人雙盲法進行BBB功能評分［1］。方法簡述如下:將造模后大鼠放置于平臺上，觀察記錄其后肢行走及肢體活動能力。評分共三部分:第一部分為0～7分，評判動物后肢各關(guān)節(jié)活動;第二部分為8～13分，評判后肢的步態(tài)及協(xié)調(diào)功能;第三部分為14～21分，評判運動中爪的精細動作，三項滿分為21分。

1.2.3 組織病理學(xué)檢測 造模后3 d各組分別取動物3只，以10%水合氯醛(0.3 mL/100g)腹腔注射麻醉。仰臥位固定在灌注臺上，剪開胸骨，暴露雙肺和心臟，經(jīng)左心室灌注37℃生理鹽水250 mL，先快后慢，硬、肝臟觸之堅韌后停止。然后將大鼠移至解剖臺上，暴露原損傷脊髓處，將包括損傷部位上下各5 mm的脊髓取出，置于4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)后固定沖出體內(nèi)血液，直至右心耳流出清亮的液體。然后繼續(xù)灌注4%多聚甲醛300 mL，前100 mL快速灌注，當(dāng)出現(xiàn)肌顫后改為緩慢灌注，直至大鼠四肢僵6 h。然后將脊髓組織經(jīng)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、制成5μm厚切片，每10張切片取1張進行常規(guī)HE染色。

1.2.4 皮層體感誘發(fā)電位 分別于術(shù)后第1周、第4周，檢測大鼠皮層體感誘發(fā)電位(cortical somato-sensory evoked potential，CSEP)(Keypoint-4 肌電圖/誘發(fā)電位儀，Medtronic 公司，美國)。方法簡述如下:用8%硫化鈉溶液將大鼠雙后肢退毛，10%水合氯醛(0.3 mL/100g)腹腔麻醉，再用0.5寸的針灸針于大鼠雙眼外眥連線的中點向后5 mm處穿刺顱骨作為記錄電極;左耳另穿一針灸針作為參考電極;接地電極置于對側(cè)后肢;用同心圓針電極于大鼠坐骨神經(jīng)處作為刺激極。給予直流方波電脈沖刺激，以2 Hz，0.2 ms方波刺激，疊加100～200次進行皮層體感誘發(fā)電位檢測。多道記錄對比，至少3道以上重復(fù)性好方可作為記錄保存。

2 結(jié)果

2.1 BBB 評分

B組術(shù)后第1天后肢出現(xiàn)短暫性活動遲緩，第2天功能明顯恢復(fù)，1周后功能恢復(fù)正常，評分20分。A組在造模后第1天出現(xiàn)精神輕度萎靡，腹壁貼地，雙后肢處于完全伸直位，無活動跡象，出現(xiàn)尿滁留，BBB評分為0。術(shù)后第1周內(nèi)未見明顯功能恢復(fù)，2周排尿反射逐漸恢復(fù)，雙后肢功能開始緩慢恢復(fù)，第4周時評分為5分，與假手術(shù)組、正常對照組相差顯著(P＜0.05)，假手術(shù)組與正常對照組1周后對比未見差異。A組內(nèi)動物之間BBB評分無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 神經(jīng)電生理檢測

CSEP檢測過程中，刺激大鼠一側(cè)坐骨神經(jīng)，在對側(cè)相當(dāng)于后肢皮層感覺區(qū)可記錄到穩(wěn)定的CSEP波形。常見的CSEP波形是由正向-負向-正向即P1、N1、P2波形組成，部分大鼠可記錄另一負向波N2波(圖1a)。檢測結(jié)果顯示:A組損傷后第一周大鼠的潛伏期無限延長，基本無法引出CSEP波(圖1b)，組內(nèi)動物的CSEP具有相同的表現(xiàn)特點。而B、C組無明顯差異，表現(xiàn)為正常的CSEP。A、B組內(nèi)CSEP有顯著性差異(P＜0.05)，A組內(nèi)動物之間CSEP無顯者差異(P＞0.05)，見表1。

表1 各組CSEP檢測結(jié)果(±s，n=9)

表1 各組CSEP檢測結(jié)果(±s，n=9)

*:與 A 組比較，P ＜0.05;﹟:與 B 組比較，P ＞0.05

圖1 大鼠CSEP圖

2.3 脊髓組織病理學(xué)檢測

大體觀察:原鉗夾部位脊髓周徑較頭尾兩端小，中央靜脈可見血栓。倒置顯微鏡下觀察:B、C組大鼠脊髓灰白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細胞形態(tài)正常、尼氏體清晰及細胞膜完整，白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維排列整齊，細胞間基質(zhì)均勻(圖2a、b)。A組動物的脊髓組織學(xué)表現(xiàn)一致，損傷區(qū)灰白質(zhì)界限不清，中央灰質(zhì)出現(xiàn)大面積出血，尼氏體消失，白質(zhì)周圍細胞腫脹、空泡變性，部分細胞胞核固縮，并有大量炎性細胞和巨噬細胞浸潤(圖2c)。

圖2 大鼠脊髓HE染色

3 討論

合理的SCI模型是開展研究的前提，理想的動物模型制作方法應(yīng)具有以下特點［2］:①制作的SCI模型與臨床相近;②對SCI模型制作的各關(guān)鍵步驟客觀化、定量化;③制作的動物模型結(jié)果一致性高;④壓迫力度、壓迫時間可自行控制，用同一方法不同的壓迫作用于動物脊髓同一部位產(chǎn)生不同程度的脊髓損傷，壓迫程度大小與脊髓損傷程度成線性關(guān)系，以便進一步施加處理因素;⑤操作簡單，即所用設(shè)備要求不高，操作不繁瑣，便于快速大批制作;⑥經(jīng)濟實用。

目前常見的有脊髓撞擊損傷、脊髓缺血再灌注損傷、脊髓切割及吸除損傷、靜壓脊髓挫傷、氣囊壓迫、光化學(xué)誘導(dǎo)、牽拉等模型。各種模型各有其優(yōu)缺點，適用的研究方向也各不相同，如:脊髓撞擊損傷模型通過調(diào)整重物的質(zhì)量和高度來復(fù)制不同程度、不同類型的脊髓損傷模型［3］;脊髓缺血再灌注損傷模型用于脊髓繼發(fā)損傷程度和損傷機制的研究;切割模型及吸除模型將脊髓全部或部分切斷，可用于解剖學(xué)評價是否有軸突再生［4-5］;牽拉性SCI通過暴露脊髓，用特殊牽拉裝置牽拉脊髓而造成損傷，多用于醫(yī)源性SCI的致傷條件和受傷機制的研究［6］;光化學(xué)誘導(dǎo)SCI是通過注射光增敏劑，然后以激光照射脊髓擬損傷部位，從而造成脊髓損傷，該模型可繼發(fā)脊髓空洞，從而模擬外傷后脊髓空洞癥［7］等。但這些動物模型仍無法模擬臨床上脊柱損傷后骨折碎片急性移位對脊髓擠壓造成的損傷，因而本課題組對此開展研究。

本實驗利用動脈瘤夾鉗夾SD大鼠T10脊髓，通過BBB評分、皮層體感誘發(fā)電位(CSEP)及組織學(xué)檢測表明，建立的動物模型能保持硬脊膜的完整性，且脊髓損傷后的解剖結(jié)構(gòu)與神經(jīng)功能的變化與挫傷型非常相似，接近于日常生活中人體脊髓損傷的類型。SCI組與假手術(shù)組、正常對照組均有明顯差異，組內(nèi)動物無顯著性差異，表明本動物模型具有良好的可行性及重復(fù)性好，且經(jīng)濟實用，可用于脊髓損傷的研究。

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