謝園園 牟 姍 薛 蔚 蔣 晨 徐維佳 倪兆慧

根據(jù)The North American Pediatric Renal Transplant Cooperative Study (NAPRTCS)的數(shù)據(jù)顯示[1-3],梗阻性腎病是導(dǎo)致成人急性腎損傷(AKI)的主要原因之一。梗阻性腎病起初腎功能緩慢下降,一旦發(fā)生AKI，患者腎功能會(huì)出現(xiàn)急劇惡化。在疾病早期發(fā)生AKI可能會(huì)加速疾病的進(jìn)程,更早進(jìn)入終末期腎病(ESRD)[4]。目前臨床上采用的傳統(tǒng)的AKI診斷標(biāo)志物——血清肌酐(SCr)或尿量標(biāo)準(zhǔn)在診斷時(shí)間上往往存在一定滯后性,有礙于臨床的早期預(yù)防和干預(yù)[5]。近年來,早期預(yù)測(cè)AKI發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)志物已成為AKI研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),其中包括一些反映腎小管損傷的指標(biāo),如腎損傷分子1(kidney injury molecule-1,KIM-1)和人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白分子(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)。一些實(shí)驗(yàn)室及臨床研究已發(fā)現(xiàn)KIM-1和NGAL可較早預(yù)測(cè)AKI的發(fā)生,但是在梗阻性腎病所致AKI中的應(yīng)用尚缺乏臨床研究。在梗阻性腎病的發(fā)展過程中,KIM-1、NGAL能否作為疾病預(yù)后的評(píng)定指標(biāo),尚需進(jìn)一步探討。本研究通過比較、分析不同時(shí)間點(diǎn)尿液KIM-1(uKIM-1)、尿液NGAL(uNGAL)的水平,評(píng)估其在梗阻性腎病所致AKI中的診斷價(jià)值,并進(jìn)一步探討其作為預(yù)測(cè)腎臟預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)的潛在價(jià)值。

對(duì)象和方法

研究對(duì)象收集2010年8月至10月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院住院的經(jīng)泌尿系超聲檢查、CT斷層掃描或腎臟核素掃描等診斷,手術(shù)明確的梗阻性腎病患者(年齡≥18歲、性別不限、臨床資料完整)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)未成年患者；(2)尿毒癥且已行規(guī)律性血液透析、規(guī)律性腹膜透析的患者；(3)其他原因引起的AKI,存在免疫系統(tǒng)疾病、實(shí)體腫瘤或其他并發(fā)癥的患者；(4)臨床癥狀提示存在急慢性感染的患者。

尿液標(biāo)本留取所有患者在術(shù)前和術(shù)后4h、8h、12h、24h、48h及72h留取新鮮尿液各10 ml。離心機(jī)2 000 r/min離心15 min后取上清液置于Eppendorf管,于-80℃冰箱保存。

指標(biāo)檢測(cè)

uKIM-1測(cè)定 uKIM-1采用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒由美國(guó)R&D公司生產(chǎn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本所對(duì)應(yīng)得濃度。所有uKIM-1濃度均用同步尿肌酐校正后以pg/(mg·Cr)表示。

uNGAL測(cè)定 uNGAL采用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒由荷蘭Hycult biotechnology公司生產(chǎn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本所對(duì)應(yīng)得濃度。所有uNGAL濃度均用同步尿肌酐校正后以ng/(mg·Cr)表示。

其他指標(biāo) 血清和尿肌酐濃度使用酶法檢測(cè),采用MDRD公式估算腎小球?yàn)V過率(eGFR),eGFR=186×(SCr/88.4)-1.154×年齡-0.203×(0．742,女性)[6]。測(cè)量指標(biāo)還包括:血脂、全血細(xì)胞、血清白蛋白(Alb)、肝功能,24h尿蛋白定量、尿白蛋白(uAlb)、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)水平等。

研究方法根據(jù)梗阻性腎病患者是否發(fā)生AKI,將患者分成AKI組及非AKI組。AKI定義為腎功能在48h內(nèi)突然減退,表現(xiàn)為SCr升高,絕對(duì)值≥26.4 μmol/L；或SCr較基礎(chǔ)值升高≥50%[7]。隨訪1年,根據(jù)患者腎功能情況將患者分成恢復(fù)組及未恢復(fù)組。腎功能恢復(fù)定義為SCr濃度降至AKI發(fā)生前的基礎(chǔ)水平或較基礎(chǔ)值升高<50%；或SCr水平保持在正常范圍。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的資料采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,組間比較采用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。運(yùn)用ROC曲線及曲線下面積(AUC)對(duì)uKIM-1、uNGAL診斷AKI的敏感度和特異度進(jìn)行評(píng)價(jià)。COX多因素回歸分析影響患者腎臟預(yù)后的相關(guān)危險(xiǎn)因素?；颊吣I臟存活率使用Kaplan-Meier生命生存曲線來進(jìn)一步分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

一般情況自2010年8月至10月間,共篩選51例患者,剔除存在并發(fā)癥且伴發(fā)感染17例、失隨訪4例，最終入選30例梗阻性腎病患者,平均年齡55.13±11.26歲(38～76歲)。男女比例為2.75∶1,其中男性22例(73.33%),平均年齡58.27±11.42歲；女性8例(26.67%),平均年齡:46.5±4.66歲。SCr水平為547 μmol/L(67.8～923 μmol/L),eGFR:7 ml/(min·1.73m2)[5～93 ml/(min·1.73m2)],24h尿蛋白總量:0 g/24h(0～1.98 g/24h),uAlb:88.22 mg/g(19.62～140.43 mg/g),uNAG:19.59 U/mg(14.93～55.64 U/mg),uKIM-1:432.32 pg/(mg·Cr)[165.40～700.00 pg/(mg·Cr)],uNGAL:456.03 ng/(mg·Cr)[211.97～1 312.53 ng/(mg·Cr)]。與正常值比較,梗阻性腎病患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血脂、血紅蛋白(Hb)、Alb等均在正常范圍(表1)。

表1 AKI組與非AKI組一般情況及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

AKI組與非AKI組間比較發(fā)生AKI患者18例,非AKI患者12例。二組間比較患者年齡、男女比例、24h尿蛋白總量、肝功能、血脂等水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AKI組uNAG、uAlb明顯高于非AKI組。非AKI組的血Hb、Alb水平高于AKI組。比較AKI組與非AKI組uKIM-1、uNGAL經(jīng)尿肌酐校正后的水平,AKI組明顯高于非AKI組(P<0.01)(表1)。

uKIM-1、uNGAL診斷梗阻性腎病所致AKI的準(zhǔn)確性分析Spearman相關(guān)分析uKIM-1與SCr呈正相關(guān)(r=0.497,P=0.002),與eGFR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.485,P=0.002)(圖1)?；颊遳NGAL水平與Scr呈正相關(guān)(r=0.553,P<0.001),與eGFR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.619,P<0.001)(圖2)。

ROC曲線分析顯示,uKIM-1的AUC為0.943,P=0.002。當(dāng)檢測(cè)的截點(diǎn)為338.26 pg/(mg·Cr)時(shí),其診斷梗阻性腎病所致AKI的敏感度和特異度分別為90%和85.7%。uNGAL診斷AKI的AUC為0.900,P=0.006。當(dāng)檢測(cè)的截點(diǎn)為261.76 ng/(mg·Cr)時(shí),其診斷的敏感度90%,特異度85.7%(圖3)。

圖3 uKIM-1、uNGAL與梗阻性腎病所致AKI的曲線下面積

影響腎臟預(yù)后的相關(guān)因素分析隨訪1年,觀察患者的腎功能情況,腎功能恢復(fù)組患者20例,未恢復(fù)組10例,兩組患者年齡、男女比例、24h尿蛋白總量、uNAG、肝功能、血脂等水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。未恢復(fù)組uKIM-1、uNGAL、uAlb高于恢復(fù)組,Hb低于恢復(fù)組(P<0.05)。

觀察腎功能未恢復(fù)組與恢復(fù)組不同時(shí)間點(diǎn)uKIM-1、uNGAL、SCr水平變化。結(jié)果顯示未恢復(fù)組術(shù)后72h uKIM-1水平顯著高于恢復(fù)組,術(shù)前、術(shù)后4h及72h uNGAL水平均顯著高于恢復(fù)組(圖4)。而比較兩組間SCr水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖4 1年后腎功能未恢復(fù)組與恢復(fù)組各時(shí)間點(diǎn)uKIM-1、uNGAL水平變化

對(duì)腎功能未恢復(fù)組進(jìn)行逐步COX回歸分析結(jié)果顯示,術(shù)后72h uKIM-1是腎臟預(yù)后的危險(xiǎn)因素(表2)，各時(shí)間點(diǎn)uNGAL水平與不良腎臟預(yù)后無明顯相關(guān)性。

ROC曲線分析預(yù)測(cè)腎臟預(yù)后的準(zhǔn)確性,術(shù)后72h uKIM-1曲線下面積為0.912,P=0.003。當(dāng)檢測(cè)的截點(diǎn)為100.23 pg/(mg·Cr)時(shí),其敏感度和特異度分別為85.7%和84.6%(圖5)。當(dāng)術(shù)后72h出現(xiàn)uKIM-1>156.00 pg/(mg·Cr),與不良腎臟預(yù)后呈明顯相關(guān)性(圖6)。

表2 影響患者長(zhǎng)期腎臟預(yù)后的相關(guān)危險(xiǎn)因素

圖5 術(shù)后72h uKIM-1預(yù)測(cè)腎臟預(yù)后的曲線下面積

圖6 術(shù)后72h尿液腎損傷分子1(uKIM-1)與腎臟預(yù)后

討 論

梗阻性腎病是因尿流障礙而導(dǎo)致腎臟功能和器質(zhì)性損害的疾病。其主要機(jī)制是:(1)腎小管管腔擴(kuò)張、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡；(2)腎臟間質(zhì)炎癥；(3)球管失衡,逐漸間質(zhì)纖維化[8]。這三個(gè)過程相互作用,互相重疊,最后導(dǎo)致腎小管萎縮,腎臟間質(zhì)纖維化,腎單位缺失。梗阻性腎病一旦發(fā)生AKI,腎功能預(yù)后差,并最終進(jìn)展為ESRD。評(píng)估和管理梗阻性腎病患者的臨床挑戰(zhàn)在于選擇手術(shù)時(shí)機(jī)和確立判斷預(yù)后的指標(biāo)[9]。

KIM-1是一種跨膜蛋白,在正常腎臟中不表達(dá),AKI臨床研究和動(dòng)物模型研究均顯示在腎臟病患者腎缺血和腎毒性損傷時(shí)腎近端小管細(xì)胞大量分泌KIM-1[10-13]。在腎近曲小管尖端處KIM-1濃度最高,尖端是腎小管最易受損的部位[14]。在臨床前實(shí)驗(yàn)[15],KIM-1已被證明是出色的腎毒性損傷標(biāo)志物,在13個(gè)不同的AIK模型研究中顯示,uKIM-1水平與腎小管損傷程度相關(guān)。尤其是輕微腎小管損傷時(shí),uKIM-1較SCr、血尿素氮、uNAG更敏感。Liangos等[16]前瞻性研究觀察了103例心肺旁路術(shù)后的患者的KIM-1水平,結(jié)果顯示,心外科術(shù)后早期AKI患者KIM-1普遍較其他指標(biāo)提早2h升高。Zhang等[17]觀察62例患者的移植腎活檢發(fā)現(xiàn),在所有急性腎小管損傷及92%發(fā)生急性細(xì)胞排斥反應(yīng)的患者腎組織KIM-1表達(dá)升高。本研究中,梗阻性腎病所致AKI組患者uKIM-1水平顯著升高,與eGRF水平呈負(fù)相關(guān),提示uKIM-1水平的升高,可反映eGFR的下降。uKIM-1診斷AKI的AUC達(dá)0.943。

Chaturvedi等[18]研究證實(shí),KIM-1的表達(dá)將持續(xù)存在,直至損傷的腎小管細(xì)胞完全修復(fù)。一項(xiàng)對(duì)不同病因的腎臟病患者進(jìn)行腎穿刺活檢的大規(guī)模臨床研究結(jié)果顯示,患者近端腎小管上皮細(xì)胞都分泌KIM-1,組織KIM-1的表達(dá)與纖維化和炎癥有關(guān)[19]。uKIM-1水平能反映組織KIM-1水平,與腎間質(zhì)炎癥和腎功能相關(guān)。這提示KIM-1不僅是急性腎近端小管損傷的生物學(xué)標(biāo)志物,也是腎小管間質(zhì)慢性炎癥及纖維化改變的標(biāo)志物。Waanders等[20]的一項(xiàng)回顧性研究顯示,非糖尿病蛋白尿患者進(jìn)行降蛋白尿治療后,尿液中KIM-1排泄下降,提示uKIM-1可能成為評(píng)價(jià)療效的指標(biāo)。uKIM-1可能是持續(xù)腎小管損害的無創(chuàng)性生物學(xué)標(biāo)志物。我們檢測(cè)梗阻性腎病患者不同時(shí)間點(diǎn)的uKIM-1水平變化,并對(duì)患者腎功能情況進(jìn)行了1年的隨訪發(fā)現(xiàn),解除梗阻術(shù)后72h的uKIM-1水平在腎功能未恢復(fù)患者及腎功能恢復(fù)患者間存在顯著差異,COX回歸分析顯示術(shù)后72h uKIM-1是腎臟預(yù)后的危險(xiǎn)因素,與不良預(yù)后呈明顯相關(guān)性。

NGAL是一種分子量為25 kDa的蛋白質(zhì),主要由中性粒細(xì)胞分泌,近端腎小管細(xì)胞等各種上皮細(xì)胞也均可分泌[21]。正常的腎臟、肺、胃和結(jié)腸組織中NGAL表達(dá)較低,然而上皮細(xì)胞受到損害時(shí)NGAL表達(dá)顯著升高,主要是由腎小管上皮細(xì)胞分泌并釋放[10]。Mishra等[22]在缺血性腎損傷模型中發(fā)現(xiàn),腎小管內(nèi)NGAL基因和蛋白的表達(dá)在短期內(nèi)出現(xiàn)大幅度升高,由此推測(cè)uNGAL可作為缺血性AKI的生物學(xué)標(biāo)志物。在小鼠動(dòng)物模型研究和AKI的臨床研究中,利用基因芯片分析,證明NGAL是腎臟缺血和腎毒性損害后最早最顯著的敏感基因之一[23]。在一些臨床前試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),在AKI早期血和尿中即可檢出NGAL蛋白,這一改變?cè)缬谀I臟的功能性改變[24]。許多臨床研究以NGAL作為AKI的生物學(xué)標(biāo)記,例如重癥監(jiān)護(hù)病房中AKI患者,心外科手術(shù)后和腎移植術(shù)后的AKI患者,觀察其血尿NGAL的升高和SCr的變化。用蛋白印跡分析測(cè)定NGAL,AKI患者2～6h內(nèi)NGAL水平升高超過10倍,而SCr在術(shù)后24～72h才上升基線值的50%。在這些研究中,血尿NGAL是AKI的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo),測(cè)量2h的血、尿NGAL的AUC為0.998和0.92[25]。本研究中,uNGAL的檢測(cè)截點(diǎn)為261.76 ng/(mg·Cr)時(shí),其診斷AKI的AUC為0.90,敏感度和特異度分別為90%和85.7%。薈萃分析顯示,uNGAL不但有助AKI的早期診斷,并且還可用于預(yù)測(cè)患者是否需行腎臟替代治療及短期預(yù)后[26]。本研究隨訪1年,比較腎功能未恢復(fù)組與恢復(fù)組間不同時(shí)間點(diǎn)uNGAL水平的變化發(fā)現(xiàn),未恢復(fù)組解除梗阻術(shù)前、術(shù)后4h及72h uNGAL水平均顯著高于恢復(fù)組,但是進(jìn)一步回歸分析顯示其與不良腎臟預(yù)后無明顯相關(guān)性。由于本研究樣本較小,uNGAL在預(yù)測(cè)腎臟預(yù)后中的價(jià)值有待進(jìn)一步研究。

NAG是細(xì)胞溶酶體內(nèi)水解酶之一,廣泛存在于人體各組織,腎組織中含量較高,尤多見于近曲小管上皮細(xì)胞。NAG也是近端腎小管損傷的生物學(xué)標(biāo)志物,目前已廣泛用于臨床[27,28]。本研究中,隨訪1年后腎功能未恢復(fù)組與恢復(fù)組uNAG水平無明顯差異,與不良腎臟預(yù)后無明顯相關(guān)性。uNAG在近端腎小管發(fā)生結(jié)構(gòu)性損傷后才升高[29]。

本研究是一個(gè)單中心小樣本的研究,存在一些不足之處,僅隨訪了1年患者的腎功能變化,未進(jìn)一步隨訪uKIM-1和uNGAL水平的變化。因此,尚需更大樣本的多中心研究,同時(shí)隨訪腎臟疾病進(jìn)程中uKIM-1和uNGAL水平的變化,進(jìn)一步驗(yàn)證這兩個(gè)生物學(xué)標(biāo)志物在監(jiān)測(cè)腎臟預(yù)后中的價(jià)值。

綜上所述,uKIM-1和uNGAL在梗阻性腎病所致AKI中診斷的準(zhǔn)確性較高,可作為臨床上AKI的診斷標(biāo)志物。同時(shí),uKIM-1還能較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)梗阻性腎病患者的腎臟預(yù)后,可作為梗阻性腎病預(yù)后不佳的早期篩查指標(biāo),幫助臨床醫(yī)師及早對(duì)這類患者進(jìn)行干預(yù),防止疾病進(jìn)展。

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