杜 麗，古力巴哈爾·阿不力米提，顧 霞，郭祥萍

B 細胞非霍奇金淋巴瘤是淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中最常見的類型，分類繁多、復雜，診斷困難，臨床預后較差。磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)是催化環(huán)腺苷酸(c－AMP)和(或)環(huán)鳥苷酸(c－GMP)水解的蛋白酶超家族。PDE4B 對c－AMP 水解失活從而廢除c－AMP 對B 淋巴細胞的抑制作用，導致B 淋巴細胞過度增殖［1］。PDE4B 在炎性反應過程中扮演重要角色，因其抑制藥具有較強的抗炎作用而作為藥物研究的新靶點［2］。BCL－2 是一種抗凋亡蛋白，在多種類型的淋巴瘤中存在高表達，認為與預后不良有關。本研究應用免疫組化技術檢測B－NHL 中PDE4B 和BCL－2 的表達，探討二者在淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及對臨床診斷、分型的意義。

1 對象與方法

1.1 對象 收集中山大學第一附屬醫(yī)院和新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科2001－2007 年診斷為B－NHL 的石蠟標本93 例，另選10 例淋巴結反應性增生做為對照。所有病例均做免疫組化CD3、CD5、CD10、CD20、CD23、CD30、CD38、CD79α、BCL－2、BCL－6、MUM－1，按照WHO2008 年淋巴造血組織腫瘤分類方案進行重新分類診斷［3］。

1.2 試劑 PDE4B(美國SIGMA 試劑公司);BCL－2(ZAME 試劑公司);S－P 超敏試劑盒(北京中杉試劑公司)。

1.3 方法 組織用10%中性緩沖甲醛固定，石蠟包埋，切厚度4 μm 切片，采用S－P 免疫組織化學染色方法，常規(guī)脫蠟至水化;枸櫞酸緩沖液(pH =6.0)中微波加熱10 min(95℃)進行抗原修復;一抗(PDE4B、BCL－2 稀釋濃度分別為1∶35，1∶50)4℃過夜，DAB 顯色，蘇木素復染。膽囊癌切片作為陽性對照，以PBS 代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定 根據(jù)腫瘤細胞中陽性細胞所占的百分比分為:≤4%為0 分，5% ～15%為1 分，16%～30%為2 分，31% ～50%為3 分，≥51%為4 分;陽性細胞的著色強度分為:無著色或與背景均勻一致的淡黃色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。兩積分相乘，0 分為陰性(－)，1 ～4 分為弱陽性(+)，5 ～8 分為中等陽性(+ +)，9 ～12 分為強陽性(+ + +)［4］。

1.5 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)應用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件處理，采用確切概率法，以P ＜0.05 有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PDE4B 在B 細胞非霍奇金淋巴瘤各亞型中的表達 有兩種定位表達模式:彌漫性細胞質著色和核旁細胞質中類似高爾基體的點狀著色(點狀著色較彌漫性著色強度強)。PDE4B 在B－NHL 中表達強度存在差異，以LPL 最高，2 例均為強陽性(++)(圖1);DLBCL 陽性率為44.26%(27/61)(圖2)、LBL 為40%，3 例BL 均不表達(表1)。

2.2 BCL－2 在B 細胞非霍奇金淋巴瘤各型中的表達 BCL－2 在淋巴瘤瘤細胞的細胞質和部分細胞膜定位表達。在FL 中全部表達;在DLBCL 陽性率為83.61%(51/61)(圖3);3 例BL 均為陰性表達(表2)。

表1 PDE4B 在B 細胞非霍奇金淋巴瘤各型中的表達

表2 BCL－2 在B 細胞非霍奇金淋巴瘤各型中的表達

圖3 BCL－2 在DLBCL 中的陽性表達(HE，×400)

2.3 PDE4B、BCL－2 在彌漫大B 細胞淋巴瘤中的表達 PDE4B 在DLBCL－GCB (生發(fā)中心型)的陽性表達率為61.54%(16/26)，在DLBCL－non－GCB(非生發(fā)中心型)的陽性表達率為31.43%(11/35)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.482，P ＜0.05)。BCL－2在DLBCL－GCB 亞型中的陽性表達率為80.77%(21/26)，在DLBCL－ non－GCB 亞型中的陽性表達率85.71%(30/35)，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。PDE4B 和BCL－2 在性別、民族、年齡、發(fā)病部位方面差異均無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，表3)。

2.4 PDE4B 在DLBCL 不同亞型中的表達形式在GCB 和non－GCB 亞型中點狀表達分別為(5/16)，(5/11);彌漫表達分別為(5/16)，(3/11);兩種同時表達分別為(6/16)，(3/11)。表達形式在DLBCL－GCB 和DLBCL－non－GCB 亞型中的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.594，P ＞0.05)。

圖4 PDE4B 在淋巴結反應性增生的表達(HE，×100)

2.5 PDE4B 和BCL－2 在淋巴結反應性增生中的表達 PDE4B 在反應性增生的濾泡生發(fā)中心吞噬細胞呈較強陽性表達，中心母細胞和中心細胞呈弱陽性表達，套區(qū)細胞呈陰性，副皮質區(qū)毛細血管內皮細胞呈陽性表達，并可見散在的小淋巴細胞呈陽性表達，竇組織細胞呈陽性表達(圖4)。BCL－2 在淋巴結反應性增生中套區(qū)小淋巴細胞和副皮質區(qū)的小淋巴細胞呈較強陽性表達，濾泡生發(fā)中心細胞(中心細胞和中心母細胞)毛細血管內皮細胞呈陰性。

表3 PDE4B，BCL－2 在彌漫大B 細胞淋巴瘤中的表達

3 討論

PDE 催化c－AMP 和c－GMP 水解開環(huán)分別生成AMP 和GMP，這是細胞內降解c－AMP 和c－GMP 的主要途徑，通過調節(jié)細胞內c－AMP 水平，從而抑制c－AMP 誘導的凋亡［5］;同時PDE4B 選擇性刺激單核細胞產生TNF－α，促進T 淋巴細胞增殖，在炎性反應、過敏反應中起著重要的作用，已作為藥物研究的新靶點［2］。Smith 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在反應性增生淋巴結生發(fā)中心的中心細胞和中心母細胞PDE4B 的水平很低(與本研究在反應性增生淋巴結的表達一致)，而DLBCL－GCB 型PDE4B 的表達水平也較低。文獻［6］報道，對化療藥物耐藥的DLBCL 為PDE4B 高表達，高表達的PDE4B 抑制了c－AMP 誘導的細胞凋亡，可促進腫瘤細胞增生。Adam Lerner 等［7］研究認為PDE4B 可作為B－NHL 的治療靶點和判斷預后指標。

本實驗中，PDE4B 在LPL、FL、MZL 中表達較高，在DLBCL、LBL、MALT 和BL 中表達較低。不同類型的淋巴瘤，PDE4B 表達變化不一，似乎與淋巴瘤侵襲性的關系不密切。病變過程呈惰性的LPL、FL、MZL，臨床上病程進展較慢，侵襲性較弱，PDE4B表達率較高;而在惡性程度較高的LBL 中表達較低，在高度侵襲性的BL 不表達。因此，筆者認為，PDE4B 與淋巴瘤的侵襲性可能呈負性相關，在判斷惰性淋巴瘤分期和預后方面可能具有一定意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，PDE4B 陽性表達的均為中等大小的瘤細胞，而惡性程度高、細胞增殖旺盛、核分裂明顯的大瘤細胞一般沒有表達;在DLBCL－GCB 中PDE4B 表達較高于non－GCB 亞型，3 例CD5+DLBCL 全部為陰性，進一步說明PDE4B 與淋巴瘤惡性程度和侵襲性呈負性相關。這與Smith 等［5］和Adam Lerner 等［7］的研究結果不一致。由于PDE4B 與淋巴瘤關系的研究報道較少，筆者推測其發(fā)生機制可能與cAMP 的活化和水解有不同途徑有關:在non－GCB 亞型中淋巴瘤細胞c－AMP 的活化路徑可能除了PDE4B，還可能有別的成員(如PDE4A 或D等)參與［8］;而在GCB 亞型的活化路徑PDE4B 可能起著主要的作用，所以表達較高。另外，61 例DLBCL 中有23 例為維吾爾族患者，是否可能存在別的作用機制，有必要做進一步的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，PDE4B 在淋巴瘤腫瘤細胞有兩種定位表達形式，有報道PDE4B 在鼠胚纖維母細胞內水解c－AMP 存在不同的亞細胞定位［9］，推測兩種表達形式可能反映了PDE4B 在細胞內功能上的變化。本研究中這兩種表達形式單獨或同時存在，在DLBCL－GCB 和non－GCB 亞型的表達差異無統(tǒng)計學意義。PDE4B 的不同表達形式是否存在功能上的差異，與腫瘤的惡性程度是否有關，尚不清。

BCL－2 也是一種原癌基因，其異常表達可促進腫瘤的發(fā)生［10］。在DLBCL 中BCL－2 陽性率為83.61%，與文獻報道及筆者前期的研究一致［11，12］。雖然在GCB 和non－GCB 亞型中沒有統(tǒng)計學差異，但兩者表達的機制卻不同，GCB 亞型通常與t(14;18)(q32;q21)染色體易位有關，易位的BCL－2 基因位于IgH 增強子調控下，導致BCL－2 過表達。而另一種表達機制是由于BCL－2 的基因擴增。Muris 等［13］推薦在GCB/ACB 相關CD10 和MUM1中加入BCL－2，進行新的預后分型，認為BCL－2可以作為DLBCL 預后的一個輔助參數(shù)。

本研究中BCL－2 在FL、LPL、MZL 表達較高(多為強陽性)，其中在FL 全部陽性，推測BCL－2對診斷FL 具有重要意義。但大多數(shù)低級別B 細胞性腫瘤均表達BCL－2，故不能作為淋巴瘤鑒別診斷的指標。

［1］ 鮑紅娟，張燕玲，喬延江. 磷酸二脂酶4 抑制劑藥效團模型的構建［J］. 中國醫(yī)藥生物技術，2008，3(4):266－272.

［2］ 湯慧芳，陳季強，王 鵬. 磷酸二脂酶4 作為抗炎藥物靶點的研究現(xiàn)狀及未來發(fā)展方向［J］. 中國藥科大學學報，2006，37(1):9－13.

［3］ Jaffy E S，Harris N L，Stein H，et al.World Health Organization Classification of Tumours Path－ologyand Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues［M］.Lyon:IARC Press，2008:168－268.

［4］ 孟 偉，石雨薇，顧 霞，等. PKC－βⅡ、NF－κBp50在彌漫性大B 細胞淋巴瘤中的表達與其意義［J］. 臨床與實驗病理學雜志，2011，27(1):56－59.

［5］ Smith P G，Wang F，Wilkinson K N，et al. The phosphodiesterase PDE4B limits c－AMP associat－ed PI3K/AKT－dependent apoptosis in diffuse large B－cell lymphoma［J］. Blood，2005，105(1):308－316.

［6］ Lerner A and Epstein P M.Cyclic nucleotide phosphodiesterases as targets for treatment of haematological malignancies［J］.Biochem J，2006，393(Pt 1):21 –41.

［7］ Dou A，Wang X. Cyclic adenosine monophosphate signal pathway in targeted therapy of lymphoma［J］. Chin Med J，2010，123(1):95－99.

［8］ Whitaker C M，Cooper N G.The novel distribution of phosphodiesterase－4 subtypes within the rat retina［J］.Neuroscience，2009，163(4):1277－1283.

［9］ Blackman B E，Horner K，Heidmann J，et al.PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts［J］. Biol Chem，2011，10:328－329.

［10］ Green D R，kroemer G. The pathophysology of mitochondrial cell death［J］. Science，2004，70:626－629.

［11］ 陽文捷，宋向群.BCL－2 和BCL－6 與淋巴瘤相關性研究進展［J］. 中華腫瘤防治雜志，2006，13 (22):1756－1759.

［12］ 顧 霞，林漢良，沈 艷，等. 不同類型淋巴瘤中survivin 和bcl 2 的表達及意義［J］. 臨床與實驗病理學雜志，2005，21(2):159－163.

［13］ Muris J J，Meijer C J，Vosw，et al.Immunohistochemical profiling based on BCL－2，CD10 and MUM1 expression improves risk stratification in patients with primary nodal diffuse large B－cell lymphoma［J］. Pathology，2006，208:714－723.