梁 靚 王 菡 李毅然 張 琦

(陜西出入境檢驗檢疫局 陜西西安 710068)

1 前言

小蠹蟲屬鞘翅目(Coleoptera)，小蠹科(Scolytidae)，是一類重要的林木害蟲。由于幼蟲的形態(tài)相似，很難分辨其種類。成蟲蟲體較小，也很難依據(jù)外部形態(tài)來鑒別，經(jīng)常給檢驗檢疫工作帶來較大困難。因此，探索用同工酶電泳技術(shù)鑒定小蠹蟲種類，對于口岸檢疫工作具有非常重要的科學(xué)意義和經(jīng)濟價值。

同工酶與生物的遺傳、生長發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有關(guān)系，而POD同工酶在動物和植物中都有存在，在植物細胞代謝過程中與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等也有一定的關(guān)系。目前同工酶電泳技術(shù)已成為研究昆蟲的遺傳變異、物種進化及種屬鑒定的重要生化指標［1］。

2 材料與方法

2.1 材料

試驗材料為海小蠹亞科的縱坑切梢小蠹(Blastophagus Piniperda Linnaeus)、齒小蠹亞科的十二齒小蠹(Ips sexdentatus Boerner)、云杉八齒小蠹(I.typographus Linnaeus)、重齒小蠹(I.duplicatus Sahalberg)、落葉松八齒小蠹(I.subelongatus Motschulsky)和中重齒小蠹(I.mannsfeldi Wachtl)以及小蠹亞科的樺邊材小蠹(Scolytus ratzeburgi Janson)。7種小蠹蟲均采自于內(nèi)蒙古二連浩特口岸，蟲體均活體采集保存于超低溫冰箱中備用。

2.2 方法

將冷凍蟲體(成蟲切除鞘翅和腹部)用蒸餾水沖洗后吸干稱重，按重量體積比(1：8)放入指形管加入緩沖液進行冰浴勻漿，將上清液作為電泳樣品冷藏備用。采用電泳溶液配置法(PAGE法)，濃縮膠濃度為 2.5%，pH6.7;分離膠濃度為 7.5%，pH8.9;電極緩沖液為Tris－Gly，pH8.3。初始電流為10 mA，當(dāng)前沿指示劑涌出濃縮膠面時，電流升至20 mA。電泳過程約5－6h。每個處理重復(fù)3次。電泳結(jié)束后取下凝膠進行染色［2］。

2.3 數(shù)據(jù)處理

相對遷移率(Rf值)計算方法如下：

x1為固定染色后酶蛋白區(qū)帶的遷移距離;x2為固定染色前指示劑的遷移距離。

3 結(jié)果與分析

3.1 7種小蠹蟲幼蟲、成蟲過氧化物酶同工酶酶帶數(shù)比較

7種小蠹蟲幼蟲、成蟲POD同工酶酶帶數(shù)目、Rf值差異較大，幼蟲和成蟲共有酶帶的Rf值均不相同，容易區(qū)分(見表1)。

表1 7種小蠹蟲幼蟲、成蟲POD同工酶酶帶數(shù)比較

3.2 7種小蠹蟲幼蟲和成蟲過氧化物酶同工酶相似性比較

根據(jù)幼蟲和成蟲POD同工酶酶帶Rf值的相似程度(表2)可以對比種的相似程度。

式中a：種A酶帶數(shù);b：種B酶帶數(shù);W：A、B兩種相同的酶帶數(shù);C：相似性系數(shù)

重齒小蠹幼蟲和中重齒小蠹無論幼蟲還是成蟲POD同工酶酶帶Rf值相似程度都最大，相似性系數(shù)C均為67%。十二齒小蠹幼蟲和重齒小蠹、中重齒小蠹幼蟲POD同工酶酶帶Rf值有較大的相似性。云杉八齒小蠹幼蟲除與十二齒小蠹幼蟲相似性系數(shù)C為40%外，與其他種小蠹蟲相似性系數(shù)均為0。十二齒小蠹成蟲和重齒小蠹、云杉八齒小蠹成蟲POD同工酶酶帶Rf值相似程度較大。重齒小蠹、中重齒小蠹成蟲與樺邊材小蠹、縱坑切梢小蠹成蟲Rf值相似性系數(shù)均為0。落葉松八齒小蠹成蟲與十二齒小蠹、重齒小蠹成蟲、云杉八齒小蠹成蟲Rf值相似性系數(shù)為0。云杉八齒小蠹成蟲與樺邊材小蠹、落葉松八齒小蠹成蟲Rf值相似性系數(shù)為0。

表2 7種小蠹蟲幼蟲、成蟲POD同工酶相似性系數(shù)C(%)

3.3 7種小蠹蟲幼蟲和成蟲過氧化物酶同工酶聚類分析結(jié)果

聚類分析7種小蠹蟲的幼蟲和成蟲(見圖1、圖2)。

圖1 7種小蠹蟲幼蟲POD同工酶聚類圖

圖2 7種小蠹蟲成蟲POD同工酶聚類圖

7種小蠹蟲POD同工酶Rf值聚類分析結(jié)果表明，中重齒小蠹與重齒小蠹的幼蟲之間和成蟲之間聚類距離系數(shù)最小，表明它們之間的親緣關(guān)系最近。5種齒小蠹在聚成一類后與縱坑切梢小蠹、樺邊材小蠹再聚類，表明5種齒小蠹之間的親緣關(guān)系最近，符合形態(tài)學(xué)分類結(jié)果。

4 討論

7種小蠹蟲POD同工酶電泳圖譜表明酶帶酶活性、數(shù)目及Rf值在種間差異明顯。酶譜缺乏穩(wěn)定性，重復(fù)性比較差。梁靚等［3］對7種小蠹蟲EST同工酶進行比較，發(fā)現(xiàn)酶帶數(shù)目比較多，并且幼蟲酶帶數(shù)目比成蟲要多。而7種小蠹蟲POD同工酶酶帶數(shù)目較少。對7種小蠹蟲POD同工酶Rf值相似性比較和聚類分析表明，中重齒小蠹與重齒小蠹的幼蟲POD同工酶Rf值相似系數(shù)最大，成蟲之間的相似系數(shù)也最大，聚類后距離系數(shù)都最小，所以它們的親緣關(guān)系最近。5種齒小蠹聚成一類后才與樺邊材小蠹、縱坑切梢小蠹聚類，表明5種齒小蠹的親緣關(guān)系比其他小蠹蟲近，符合形態(tài)學(xué)分類結(jié)果。

POD同工酶圖譜中幼蟲的酶帶數(shù)目多于成蟲，幼蟲和成蟲相同Rf值的酶帶數(shù)目較少，有的幼蟲或成蟲未顯示出酶帶，所以沒有充分體現(xiàn)出來種內(nèi)的共性。以上結(jié)果表明，能否用POD同工酶電泳酶譜來鑒定不同種間的小蠹蟲還有待于進一步研究探討。

黃斑星天牛Anoplophora nobilis(Ganglbauer)和光肩星天牛A.glabripennis(Motschulsky)的外部形態(tài)很難區(qū)分，蔣京閩等［4］對它們的POD同工酶比較研究后，認為2個種是獨立的種類，但他們之間的親緣關(guān)系很近。唐樺等［5］對這2種天牛的EST同工酶進行比較，判定它們屬于同一個種，將黃斑星天牛作為光肩星天牛的同物異名。POD同工酶在昆蟲中的研究目前還較少，對POD同工酶在物種鑒別上的準確性還有待于繼續(xù)研究。而大量EST同工酶的研究表明，不同種間的同工酶圖譜清晰可見，在低級階元(亞科以下水平)的分類中更具有鑒別性的意義。

［1］李鶴，施宗偉，沈佐銳.三種瘤背豆象幼蟲酯酶同工酶的比較研究［J］.昆蟲知識，2001，38(1)：62 －64.

［2］胡能書，萬國賢.同工酶技術(shù)及其應(yīng)用［M］.長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1985.

［3］梁靚，段立清，尹鳳民，等.7種小蠹蟲酯酶同工酶的比較研究［J］.植物保護，2007，33(6)：70 －74.

［4］蔣京閩，宋玉霞.兩種天牛的過氧化物酶同工酶的比較研究［J］.昆蟲知識，1988，25(5)：293 －294，297.

［5］唐樺，鄭哲民.光肩星天牛與黃斑星天牛酯酶同工酶的比較研究［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，24(1)：66 －68.