楊 青 王 堯 李里香 況九龍

支氣管哮喘（哮喘）是我國(guó)常見(jiàn)病之一。臨床上對(duì)于輕中度哮喘常規(guī)用激素治療，療效確切，但對(duì)于難治性、重癥哮喘或皮質(zhì)激素抵抗型哮喘，激素治療效果不甚理想。對(duì)于哮喘氣道重塑發(fā)病機(jī)制至今仍不十分清楚，其中氧化/抗氧化失衡學(xué)說(shuō)是近年來(lái)討論的熱點(diǎn)，即認(rèn)為哮喘是由于機(jī)體活性氧增多、脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)和（或）抗氧化能力降低，最終導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡[1]。持續(xù)反復(fù)引起肺損傷，從而進(jìn)一步加重哮喘發(fā)作。茶多酚（tea polyphenols，TP）是從茶葉中提取的一種純天然抗氧化藥物，主要成分是4個(gè)含有兒茶素的單體，通過(guò)提供大量羥基來(lái)清除氧自由基，具有強(qiáng)抗氧化、抗突變、抗癌變、抗菌、抗病毒等多種生物學(xué)功能[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究茶多酚對(duì)支氣管哮喘大鼠早期及晚期氣道炎癥、氣道重塑與氧化應(yīng)激水平的干預(yù)及影響，并探討哮喘氣道重塑發(fā)生的可能機(jī)制，以指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原菌級(jí)別雌性SD大鼠48只，4～6周齡，體質(zhì)量（160±10）g，購(gòu)自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在溫度為（25±1）℃的飼養(yǎng)室中群居飼養(yǎng)，提供充足的食物和水源。所有動(dòng)物在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前至少飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。

1.2 主要試劑和儀器 HE病理染色試劑盒、Masson病理染色試劑盒、PAS病理染色試劑盒購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1成套免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；茶多酚購(gòu)自四川樂(lè)山禹伽茶業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司 （批號(hào)：TP-050801）。圖像采集系統(tǒng)、采集軟件（日本OLYMPUS公司）；ImagePro-plus 6.0真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析軟件（德國(guó)Leica公司）。

1.3 哮喘模型的制備 48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成對(duì)照組、哮喘組、早BUD組、早TP組、晚BUD組、晚TP組，每組8只。除對(duì)照組外，其他各組均進(jìn)行哮喘模型的制備。參照Palmans等[3-4]的方法并稍做改進(jìn)：在造模第1天、第8天各注射卵蛋白（OVA）混懸液1 mL；對(duì)照組用1 mL生理鹽水代替。致敏2周（造模15 d）后霧化吸入OVA，每次霧化約30 min，隔日1次，對(duì)照組用生理鹽水霧化。以大鼠出現(xiàn)煩躁、搔鼻、呼吸加快、口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、點(diǎn)頭呼吸及四肢癱軟等表現(xiàn)為激發(fā)成功。

1.4 給藥方法 早BUD組：在造模前2周，開(kāi)始霧化0.02%布地奈德，每次20 min，每日1次。在造模時(shí)期，于霧化1%OVA前2 h時(shí)開(kāi)始霧化布地奈德，方法同前。晚BUD組：在造模5周后，于霧化1%OVA前2 h開(kāi)始霧化0.02%布地奈德，每次20 min，每日1次。早TP組：在造模前2周，開(kāi)始茶多酚灌胃[400 mg/（kg·d）]，每日 1 次。 在造模時(shí)期，于霧化1%OVA前2 h時(shí)開(kāi)始茶多酚灌胃，方法同前。晚TP組：在造模5周后，于霧化1%OVA前2 h時(shí)開(kāi)始茶多酚灌胃[400 mg/（kg·d）]，每日 1 次。各組均干預(yù)至造模后 12 周。哮喘組除造模時(shí)用的OVA外不用其他藥物干預(yù)。對(duì)照組僅予等量生理鹽水。

1.5 肺組織病理切片、染色、分析 右肺中葉用4%中性多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋和切片，片厚3 μm，分別行HE染色、Masson染色、PAS染色和免疫組化染色。采用Img-Pro 6.0圖像分析系統(tǒng)，每張切片在400倍顯微鏡下，確定5個(gè)完整支氣管橫截面，分別測(cè)取其支氣管基底膜內(nèi)壁周徑(Pbm)、平滑肌面積（WAm）、膠原沉積面積（Wcol），并用Pbm將測(cè)量值標(biāo)化，分別以WAm/Pbm和Wcol/Pbm代表相應(yīng)管壁層的厚度，每個(gè)支氣管各測(cè)5次，取其均值。測(cè)定TGF-β1免疫組化染色切片的積分光密度（IOD）值，每張切片隨機(jī)讀取10個(gè)視野測(cè)定IOD值，取平均值。

1.6 肺組織TGF-β1含量測(cè)定及氧化應(yīng)激水平測(cè)定 采用ABC-ELISA測(cè)定肺組織中TGF-β1含量。采用TBA法測(cè)定MDA含量，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力。操作按試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理改變 （1）HE染色顯示，哮喘組與對(duì)照組相比，支氣管壁、間隔及血管周?chē)写罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，管腔明顯變窄。早BUD組上述變化較哮喘組改善，晚BUD組改善不明顯。（2）PAS染色顯示，與早TP組相比，哮喘組支氣管上皮杯狀細(xì)胞明顯增加，氣道內(nèi)黏液分泌旺盛。（3）Masson染色顯示，晚TP組支氣管壁周?chē)交〖?xì)胞核呈深棕色、細(xì)胞漿呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。晚BUD組平滑肌增生、肥大明顯，氣道上皮下膠原沉積明顯增多。（4）TGF-β1免疫組化染色結(jié)果顯示，哮喘組TGF-β1廣泛表達(dá)，主要表達(dá)在氣道黏膜上皮層，平滑肌、炎性細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)也有表達(dá)。晚TP組TGF-β1表達(dá)減少，見(jiàn)圖1。

2.2 各組間WAm/Pbm、Wcol/Pbm及TGF-β1的比較 對(duì)照組、早BUD組、早TP組和晚TP組WAm/Pbm、Wcol/Pbm及TGF-β1均低于哮喘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。早BUD組與早TP組、晚BUD組與哮喘組之間上述指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.3 各組肺組織TGF-β1、MDA含量及SOD活性的比較 對(duì)照組、早TP組、早BUD組和晚TP組的MDA含量和TGF-β1的含量均低于哮喘組，SOD活性高于哮喘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。早BUD組與早TP組、晚BUD組與哮喘組的上述指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05），見(jiàn)表2。

Figure 1 Pathological sections of airway wall in different groups圖1 各組氣道壁病理切片

2.4 相關(guān)性分析 肺組織MDA含量與SOD活性呈負(fù)相關(guān) （r=-0.573，P<0.01）。 TGF-β1 含量與MDA 含量呈正相關(guān)（r=0.458，P<0.01）。

Table 1 Comparison of lung pathological sections between different rat groups表1 各組大鼠肺組織病理切片比較±s）

Table 1 Comparison of lung pathological sections between different rat groups表1 各組大鼠肺組織病理切片比較±s）

*P<0.05，**P<0.01

對(duì)照組（1）哮喘組（2）早 BUD 組（3）早 TP 組（4）晚 BUD 組（5）晚 TP 組（6）F q（1）∶（2）（2）∶（3）（2）∶（4）（2）∶（5）（2）∶（6）（3）∶（4）888888 WAm/Pbm（μm）3.68±0.46 8.72±1.58 4.63±0.83 4.84±0.92 8.09±1.25 7.01±1.07 29.33**13.24**10.75**10.20**1.66 4.49*0.55 Wcol/Pbm（μm）4.20±1.75 17.98±6.67 5.01±1.00 5.07±1.03 16.46±3.32 12.82±2.33 28.32**11.75**10.98**11.00**1.30 4.40*0.03 TGF-β1（IOD 值）1.28±0.31 10.42±2.88 2.26±0.63 2.36±0.91 9.73±2.12 8.07±1.64 49.52**15.45**13.79**13.62**1.17 3.97*0.17組別 n

Table 2 Comparison of contents of MDA,SOD and TGF-β1 in lung tissues between different rat groups表 2 各組大鼠肺組織中MDA、SOD 、TGF-β1的水平比較±s）

Table 2 Comparison of contents of MDA,SOD and TGF-β1 in lung tissues between different rat groups表 2 各組大鼠肺組織中MDA、SOD 、TGF-β1的水平比較±s）

*P<0.05，**P<0.01

對(duì)照組（1）哮喘組（2）早 BUD 組（3）早 TP 組（4）晚 BUD 組（5）晚 TP 組（6）F q（1）∶（2）（2）∶（3）（2）∶（4）（2）∶（5）（2）∶（6）（3）∶（4）888888 MDA（μmol/g）5.67±1.09 12.81±3.32 6.97±1.32 6.88±1.28 10.84±2.47 8.71±1.62 17.40**10.03**8.96**9.10**2.02 6.29*0.14 SOD（U/mg）129.65±7.16 94.39±5.37 123.27±8.77 124.00±7.68 110.68±6.30 114.64±6.56 25.72**14.13**11.58**11.87**2.53 8.12*0.29 TGF-β1（mg/L）48.21±9.38 128.32±16.24 56.46±9.87 58.42±10.34 118.12±13.42 103.21±12.87 65.77**18.48**16.58**16.13**2.35 5.79*0.45組別 n

3 討論

支氣管哮喘的基本特征為氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑[5]。氧化應(yīng)激上調(diào)了Th2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，增加了支氣管高反應(yīng)性，促使了氣道重塑的形成[6]。SOD作為體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其水平高低間接反映了細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，哮喘肺組織中MDA含量升高，SOD活力明顯下降，經(jīng)藥物干預(yù)后，氧化應(yīng)激水平下降，以早TP組、早BUD組明顯，晚TP組次之，晚BUD組無(wú)明顯改善。

目前哮喘治療指南強(qiáng)調(diào)吸入激素控制哮喘氣道炎癥。吸入激素可以有效地減輕哮喘癥狀，減少哮喘發(fā)作的頻率和減輕發(fā)作時(shí)的嚴(yán)重程度，降低病死率[7]。有研究表明激素能改善氣道重塑[8-9]，然而激素減緩氣道重塑的作用尚存在爭(zhēng)議[10]。TGF-β1具有強(qiáng)烈的致纖維化作用，是哮喘氣道重塑的主要調(diào)控因子，可引起成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成增加、降解減少，導(dǎo)致氣道重塑。TGF-β1表達(dá)量增加與氣道膠原沉積面積呈正相關(guān)。本研究中觀察到早TP組、晚TP組、早BUD組干預(yù)后各項(xiàng)氣道重塑指標(biāo)（WAm/Pbm、Wcol/Pbm、TGF-β1）較哮喘組均有改善，以早TP組改善最明顯。晚期BUD組干預(yù)效果差，與臨床上觀察到激素對(duì)已經(jīng)形成氣道重塑的哮喘患者療效一致。此外，激素抵抗型哮喘患者對(duì)激素治療反應(yīng)差，易發(fā)展成氣道重塑。因此，對(duì)激素抵抗型哮喘患者需早期識(shí)別，在早期使用可替代的非激素的抗炎藥物以減緩氣道重塑的發(fā)生。

研究表明，在小鼠慢性哮喘模型中，予氧化還原劑活性蛋白硫氧還蛋白-1（TRX1）干預(yù)可明顯抑制氣道重塑的發(fā)生，對(duì)已出現(xiàn)的氣道重塑也有減緩作用[11]。茶多酚具有超強(qiáng)的抗氧化作用，能直接清除超氧陰離子、羥自由基，抑制亞硝酸的形成及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA的合成與轉(zhuǎn)錄，降低一氧化氮的蛋白水平及酶的活性，調(diào)節(jié)氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡[12]，從而提高抗氧化酶SOD活力，對(duì)抗自由基對(duì)血管內(nèi)皮的損傷，改善微循環(huán)，減少支氣管黏膜的滲出，這些都是治療慢性哮喘的氣道重構(gòu)所必需的。本研究也觀察到即使在氣道重塑建立后給予茶多酚干預(yù)，肺組織病理切片的膠原沉積等病理改變?nèi)杂懈纳谱饔谩４送?，與激素相比較，茶多酚不良反應(yīng)小[13]，這也是其他許多治療哮喘藥物所不具備的。應(yīng)用茶多酚治療能有效地清除體內(nèi)的氧自由基、降低DNA的氧化損傷，抑制肺組織氣道重塑的進(jìn)程，其機(jī)制可能是通過(guò)提高體內(nèi)抗氧化酶SOD的活性，降低肺組織中MDA的水平，減少氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從而有效改善慢性哮喘氧化/抗氧化失衡。

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