彭 清，溫雪萍，顏志軍，高習(xí)文

(上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 201199)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)的疾病，在吸煙等環(huán)境因素的作用下，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增加。和支氣管哮喘一樣，COPD也是一個(gè)氣道炎癥性疾病，中性粒細(xì)胞的募集和活化是COPD發(fā)病中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TH17細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的除TH1細(xì)胞和TH2細(xì)胞之外的 CD4+T細(xì)胞［1-2］，其分泌的IL-17具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞的功能［3-6］。THl7細(xì)胞在COPD的發(fā)病中扮演重要角色［7］。因此，進(jìn)一步探討TH17細(xì)胞在COPD中的具體作用及其機(jī)制顯得尤為迫切。近年來(lái)，糖皮質(zhì)激素在COPD尤其是重度、極重度COPD中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。糖皮質(zhì)激素能降低IL-17、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)［8-9］，那么糖皮質(zhì)激素是否也通過(guò)對(duì)TH17的調(diào)節(jié)達(dá)到抑制COPD慢性炎癥過(guò)程，目前尚無(wú)報(bào)道。本課題通過(guò)比較健康人群、COPD穩(wěn)定期患者TH17細(xì)胞構(gòu)成和細(xì)胞因子分泌情況，探討TH17細(xì)胞在COPD中的作用;通過(guò)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素對(duì)COPD患者進(jìn)行干預(yù)，探討糖皮質(zhì)激素是否通過(guò)對(duì)TH17的調(diào)節(jié)達(dá)到抑制COPD慢性炎癥過(guò)程。本研究有助于明確COPD的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于今后COPD患者的治療提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑

PE-CY5抗人CD4單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)購(gòu)自BD pharmingen公司。PE抗人IL-17mAb及同型對(duì)照均購(gòu)自ebioscience公司。佛波酯(Phorbol 12-myristate-13-acetate，PMA)、離子霉素(Ionomycin)、莫能菌素(Monensin)、植物血凝素P(Phytohenmagglutinin-P，PHA)及皂素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海博蘊(yùn)生物科技有限公司。RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。人細(xì)胞因子IL-17、IL-4及IFN-γ的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自R＆D公司。

1.2 研究對(duì)象

根據(jù)慢性阻塞性肺疾病診治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)，吸入支氣管舒張劑后第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)/用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)＜70%，F(xiàn)EV1占預(yù)計(jì)值＜50%，選取1個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用全身激素的COPD穩(wěn)定期患者共38例，所有患者給予規(guī)律吸入布地奈德800 μg/d，研究持續(xù)3個(gè)月，3個(gè)月后為治療組。研究期間若出現(xiàn)癥狀，可按需使用短效支氣管擴(kuò)張劑，其中8例出現(xiàn)COPD急性加重，予以剔除，剩余30例為COPD穩(wěn)定期組，其中男性22例，女性8例，平均年齡(58.53±6.94)歲。我院門診不吸煙的健康體檢者30例為正常對(duì)照組，其中男性20例，女性10 例，平均年齡(55.30 ±6.99)歲，兩周內(nèi)無(wú)急性感染，無(wú)長(zhǎng)期用藥史，肺功能正常。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選患者均簽署知情同意書(shū)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血TH17細(xì)胞的表達(dá)

抽取入選研究對(duì)象的外周靜脈血3 ml(肝素抗凝)，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，調(diào)整PBMC密度至2×106ml。懸浮于RPMIl640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和0.1 ng/ml鏈霉素)。取PBMC懸液(2×106ml－1)加入24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 ml，加入PMA(20 ng/ml)、離子霉素(1 μg/ml)和莫能菌素(2 nmol/ml)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h(37℃，5%CO2)。收集細(xì)胞后分為同型對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管，加入PE-CY5抗人CD4 mAb 10 μl避光室溫孵育30 min。洗滌棄上清，予4%多聚甲醛固定，室溫放置 20 min。予 0.1%皂素穿膜10 min，離心棄上清，每管約留200 μl穿膜液重懸細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)管加入PE抗人 IL-17 mAb 10 μl，同型對(duì)照管加入同型對(duì)照抗體，室溫避光孵育1 h。洗滌后重懸細(xì)胞于300 μl洗滌液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分出CD4+細(xì)胞，以散點(diǎn)圖表示IL-17+細(xì)胞，用CellQuest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。

1.4 ELISA 檢測(cè) IL-17、IL-4、IFN-γ 水平

抽取入選研究對(duì)象的外周靜脈血5 ml(肝素抗凝)。全血離心后收集血漿－80℃凍存待ELISA檢測(cè)。取上述凍存的血漿，通過(guò)ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)細(xì)胞因子 IL-17、IL-4、IFN-γ，具體操作按照試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)資料均以±s表示。所有數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)分析采用方差分析及q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外周血TH17細(xì)胞比例

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志及細(xì)胞因子的檢測(cè)顯示，外周血中CD4+IL-17+細(xì)胞(TH17細(xì)胞)比例在三組之間有顯著差異(P＜0.05)，COPD穩(wěn)定期組TH17細(xì)胞在外周血CD4+陽(yáng)性細(xì)胞中所占的比例(3.13±0.91)%，要高于治療組(2.30±1.95)%和正常對(duì)照組(1.21 ±0.40)%，治療組外周血中TH17細(xì)胞比例也顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。

2.2 血漿中 IL-17、IL-4、IFN-γ 水平

ELISA檢測(cè)表明，血漿中 IL-17和 IFN-γ水平在三組之間有顯著差異(P＜0.01)，其中COPD穩(wěn)定期組要高于治療組和正常對(duì)照組，而治療組也均高于正常對(duì)照組。血漿中IL-4水平在三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表 1 血漿 IL-17、IL-4、IFN-γ水平Tab.1 Comparison of levels of plasma IL-17，IL-4 and IFN-γ in three groups(pg/ml)

3 討 論

COPD是世界范圍內(nèi)危害人類健康的疾病，發(fā)病率和死亡率都很高，其確切發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，反復(fù)發(fā)生的氣道慢性炎癥在COPD的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用，中性粒細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞是COPD異常炎癥反應(yīng)的三種關(guān)鍵細(xì)胞，有多種細(xì)胞因子、趨化介質(zhì)、蛋白酶和氧化應(yīng)激等參與COPD炎癥的發(fā)生。中性粒細(xì)胞的募集和活化是COPD發(fā)病中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究提示:COPD患者支氣管肺泡灌洗液及誘導(dǎo)痰中中性粒細(xì)胞明顯增加，甚至在已戒煙患者發(fā)現(xiàn)了同樣的炎癥過(guò)程，表明炎癥發(fā)生后即在氣道內(nèi)持續(xù)存在，且肺功能測(cè)量值第1秒用力呼氣容積(FEV1)與氣道中性粒細(xì)胞的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)［10］。COPD患者嚴(yán)重程度越重往往中性粒細(xì)胞數(shù)量越高，氣道炎癥越顯著。中性粒細(xì)胞在呼吸道大量滲出是COPD炎癥反應(yīng)的特征，但中性粒細(xì)胞活化和聚集的機(jī)制尚未完全清楚，目前認(rèn)為與巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞等所釋放炎性趨化因子的作用和粘附機(jī)制相關(guān)。

TH17細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的除TH1細(xì)胞和TH2細(xì)胞之外的CD4+T細(xì)胞，分泌IL-17、IL-6和TNF-α，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［11］。THl7細(xì)胞分泌的IL-17能在組織局部誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和趨化因子，促進(jìn)中性粒細(xì)胞向病灶部位遷移［3-4，12］。IL-17敲除小鼠不能招募中性粒細(xì)胞至感染部位，從而使遲發(fā)型超敏反應(yīng)、接觸性過(guò)敏反應(yīng)下降。中性粒細(xì)胞是COPD異常炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞，THl7細(xì)胞分泌的IL-17具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞的功能，那么THl7細(xì)胞在COPD的發(fā)病中是否扮演重要角色，認(rèn)為細(xì)菌、病毒、一些非典型病原體及大氣污染等均可導(dǎo)致COPD急性加重，而這些因素可能影響了TH17細(xì)胞的表達(dá)，因此本課題僅選取COPD穩(wěn)定期患者作為研究對(duì)象。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志及細(xì)胞因子的檢測(cè)顯示，COPD穩(wěn)定期組外周血中TH17細(xì)胞表達(dá)要顯著高于正常對(duì)照組，同樣ELISA檢測(cè)表明，COPD穩(wěn)定期組血漿中IL-17的表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，結(jié)合目前國(guó)內(nèi)外的研究我們認(rèn)為，TH17細(xì)胞可能通過(guò)其釋放的IL-17誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞釋放IL-6、IL-8、前列腺素E、粒細(xì)胞集落刺激因子等，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、TNF-α，促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化與激活，從而參與COPD的氣道炎癥［13-15］。近年來(lái)，有學(xué)者提出了COPD是自身免疫性疾病的假設(shè)［16-20］。已有一些證據(jù)顯示，TH17細(xì)胞是自身免疫性疾病的重要致病因素［21］，其分泌的IL-17可能通過(guò)誘導(dǎo)和維持炎癥，參與適應(yīng)性免疫在COPD 的發(fā)生、發(fā)展中起作用［22］。

以往的研究認(rèn)為激素在哮喘中有效，是因?yàn)榭梢砸种葡瓪獾乐械氖人嵝粤＜?xì)胞炎癥，COPD穩(wěn)定期沒(méi)有嗜酸性粒細(xì)胞，主要為嗜中性粒細(xì)胞，而中性粒細(xì)胞炎癥對(duì)激素抵抗，故不主張將激素應(yīng)用于COPD［23-24］。糖皮質(zhì)激素在COPD尤其是重度、極重度COPD中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。Gartlehner等［25］對(duì)ICS治療COPD的臨床研究資料做了薈萃分析，結(jié)果表明與安慰劑相比，長(zhǎng)期應(yīng)用ICS雖然不影響COPD的死亡率，但可顯著減少急性加重的次數(shù)。2008年GOLD推薦ICS適用于有呼吸道癥狀，第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值的百分比(FEV1%)＜50%，而且有反復(fù)急性加重的COPD患者。那么糖皮質(zhì)激素究竟通過(guò)什么途徑發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。TH17的發(fā)現(xiàn)可能為此提供了啟示。Prause等［8］研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素能顯著降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠肺組織、支氣管灌洗液中IL-17的表達(dá)，從而抑制了中性粒細(xì)胞的聚集，發(fā)揮其抗炎作用。還有研究報(bào)道在H5N1病毒誘發(fā)小鼠ARDS的模型中，糖皮質(zhì)激素能夠顯著降低支氣管灌洗液中IL-6和TNF-α的表達(dá)［9］。本研究表明COPD穩(wěn)定期組TH17細(xì)胞和血漿中IL-17的表達(dá)要顯著高于正常對(duì)照組，給予吸入糖皮質(zhì)激素治療后，TH17細(xì)胞和血漿中IL-17的表達(dá)較前明顯降低，仍高于正常對(duì)照組。糖皮質(zhì)激素可能通過(guò)對(duì)TH17細(xì)胞的抑制，降低了其分泌的細(xì)胞因子水平，減少了其炎性效應(yīng)，從而緩解了臨床癥狀，改善生活質(zhì)量。

綜上所述，TH17細(xì)胞可能通過(guò)其釋放的IL-17，促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化與激活，從而在COPD的發(fā)生、發(fā)展各個(gè)環(huán)節(jié)中起著重要作用，而糖皮質(zhì)激素可能通過(guò)對(duì)TH17的調(diào)節(jié)達(dá)到抑制COPD慢性炎癥過(guò)程。TH17細(xì)胞表達(dá)水平的增加是否可作為一種判斷COPD及其預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)，以及以TH17細(xì)胞中心的靶像治療在COPD中的可行性與有效性尚需大樣本多因素的臨床實(shí)驗(yàn)研究來(lái)支持。進(jìn)一步研究TH17細(xì)胞在COPD中的作用和各種具體機(jī)制，尤其是基因調(diào)控機(jī)制，不僅對(duì)更深入了解COPD的發(fā)病機(jī)制，而且對(duì)COPD患者的預(yù)后評(píng)估以及臨床治療都有著非常重要的意義。

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