倪菊花，翟玉娟，周 筠，雷 濤

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200065)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種以單位體積內(nèi)骨量降低，骨組織微結(jié)構(gòu)退化，骨皮質(zhì)變薄，骨小梁數(shù)目減少，骨髓腔增寬，骨強(qiáng)度減低為特征，導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加易于發(fā)生骨折的全身性疾病。隨著我國(guó)人口的老齡化，骨質(zhì)疏松癥正在成為一種新型的流行病，由骨質(zhì)疏松癥引起的骨折及其他并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，給國(guó)家和社會(huì)造成了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，如何有效預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥成為了近年來(lái)研究的一大熱點(diǎn)。眾多研究表明，血脂紊亂和骨質(zhì)疏松之間關(guān)系密切［1-4］，但結(jié)論不一，仍存在著很大的爭(zhēng)議，且其之間相互關(guān)聯(lián)的確切機(jī)制也尚不明確。本課題擬檢測(cè)低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)對(duì)于MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖、分化能力的影響，并利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)LDL作用下的LRP5、DKK1基因mRNA表達(dá)情況，以分析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

成骨細(xì)胞株MC3T3-E1購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，于同濟(jì)醫(yī)院保種。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器

LDL購(gòu)于廣州奕源生物科技有限公司，小鼠骨鈣素ELISA Kit購(gòu)于美國(guó)IBL公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司，高糖a-MEM培養(yǎng)基及胎牛血清均購(gòu)自美國(guó) Gibco公司，TRIzol購(gòu)于Invitrogen公 司，PrimeScriptTM RT reagentKit(Perfect Real Time)DRR037A購(gòu)于Takara公司，SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)DRR041A購(gòu)于Takara公司，引物由上海生工生物有限公司合成。酶標(biāo)儀(METERTECH Σ960)，培養(yǎng)箱(Thermo HEPA class100)，熒光定量 PCR儀(Roche Cycler application system Version 1.5)。

1.3 LDL對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1細(xì)胞，配細(xì)胞懸液密度為2×104/ml后，在96孔板選擇20孔，分別在24、48、72 h三個(gè)時(shí)間組。每個(gè)時(shí)間組里分 0.05、0.10、0.20 mg/ml LDL 和空白對(duì)照組。每孔注入100 μl細(xì)胞懸液，對(duì)于實(shí)驗(yàn)組每孔細(xì)胞，輕輕注入相應(yīng)量LDL和一定量的無(wú)血清的a-MEM培養(yǎng)液，使實(shí)驗(yàn)總體系為150 μl，使LDL混合液濃度分別達(dá)到0.05、0.10、0.20 mg/ml。對(duì)照組均加入 100 μl的細(xì)胞懸液，每孔再加入50 μl的無(wú)血清a-MEM 培養(yǎng)液，每一濃度做5個(gè)復(fù)孔。按24、48、72 h三個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間段進(jìn)行如下操作:每孔加入10 μl的CCK8溶劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度(OD)值。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)液中骨鈣素水平的測(cè)定

細(xì)胞傳代后培養(yǎng)于直徑為6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，約70%融合時(shí)同上分別加入相應(yīng)量的LDL和一定量的無(wú)血清的a-MEM培養(yǎng)液，使實(shí)驗(yàn)總體系為2 ml，使 LDL 混合液濃度分別達(dá)到 0.05、0.10、0.20 mg/ml。并設(shè)對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用OC測(cè)定試劑盒(EL ISA法)檢測(cè)給藥組、對(duì)照組細(xì)胞上清OC水平。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔中各加入樣品稀釋液100 μl，第一孔加標(biāo)準(zhǔn)品 100 μl，混勻后用加樣器吸出100 μl，移至第二孔，如此反復(fù)作倍比稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出100 μl棄去，使之體積均為100 μl，第八孔為空白對(duì)照。參照美國(guó)IBL公司小鼠骨鈣素ELISA Kit說(shuō)明書(shū)完成ELISA，在450 nm處測(cè)吸光值。結(jié)果計(jì)算與判斷:所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 ng/ml之 OD 值在半對(duì)數(shù)紙上作圖，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)樣品OD值在該曲線(xiàn)圖上查出相應(yīng)小鼠Osteocalcin含量。

1.5 小鼠成骨細(xì)胞中LRP5、DKK1mRNA的表達(dá)

分別以 0.05、0.10、0.20 mg/ml濃度的 LDL 作用于成骨細(xì)胞MC3T3-E1 24、48和72 h。熒光定量PCR檢測(cè)DKK1和LRP5 mRNA的表達(dá)，分別收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，根據(jù)Takara RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行cDNA合成和PCR擴(kuò)增。引物根據(jù)Medline基因文庫(kù)用 Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)(表1)。反應(yīng)結(jié)束后，RQ manager分析軟件統(tǒng)計(jì)處理，獲取Ct值，并根據(jù)熔解曲線(xiàn)判斷產(chǎn)物的純度。

表1 各基因和內(nèi)參引物Tab.1 Genes and Internal control primers

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)檢測(cè)三次，去除異常值后取平均值，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析統(tǒng)計(jì)CCK8和ELISA實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組之間的差異。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，結(jié)果分析根據(jù)Kenneth［5］的描述，采用半定量分析。樣品數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，本實(shí)驗(yàn)用單因素方差分析檢測(cè)LRP5、DKK1 mRNA在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LDL對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在24 h LDL濃度為0.05 mg/ml時(shí)，成骨細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。LDL作用時(shí)間為48 h，濃度為0.20 mg/ml時(shí)，對(duì)該株細(xì)胞增殖的抑制作用最大，為63.48%。單因素方差分析顯示同一時(shí)間點(diǎn)，0.05、0.10、0.20 mg/ml HDL 和 LDL 濃度組和對(duì)照組OD值差異顯著(P＜0.01);同一濃度，24、48、72 h不同作用時(shí)間 OD值差異顯著(P＜0.01)，提示LDL對(duì)成骨細(xì)胞增殖的作用在一定程度上呈劑量及作用時(shí)間依賴(lài)性，見(jiàn)圖1。

2.2 LDL對(duì)小鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中骨鈣素水平的影響

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在24 h濃度為0.05 mg/ml LDL明顯抑制成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中的骨鈣素表達(dá)，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。單因素方差分析顯示同一時(shí)間點(diǎn)，0.05、0.10、0.20 mg/ml LDL濃度組和對(duì)照組骨鈣素水平差異顯著(P＜0.01)，而同一濃度，24、48、72 h 不同作用時(shí)間骨鈣素水平差異顯著(P＜0.01)，提示LDL對(duì)成骨細(xì)胞骨鈣素表達(dá)的抑制作用在一定程度上具有LDL劑量及作用時(shí)間依賴(lài)性(圖2)。

2.3 LDL對(duì)小鼠成骨細(xì)胞LRP5、DKK1 mRNA表達(dá)的影響

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在48 h濃度為0.05 mg/ml LDL明顯下調(diào)成骨細(xì)胞中的 LRP5 mRNA表達(dá)水平，顯著上調(diào)DKK1 mRNA表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。單因素方差分析顯示當(dāng)作用時(shí)間為24 h，0.05、0.10、0.20 mg/ml LDL 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組 LRP5 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)，作用時(shí)間為48 h 和 72 h，0.05、0.10、0.20 mg/ml LDL 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組LRP 5 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯差異(P＜0.01)。同一濃度，24、48、72 h 不同作用時(shí)間LDL實(shí)驗(yàn)組LRP5 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異顯著(P＜0.01)。當(dāng)作用時(shí)間為 24 h，0.05、0.10、0.20 mg/ml，LDL實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組DKK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)，作用時(shí)間為48 h和 72 h，0.05、0.10、0.20 mg/ml LDL 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組DKK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯差異(P＜0.01)，同一濃度，24、48、72 h不同作用時(shí)間 LDL實(shí)驗(yàn)組DKK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異顯著(P＜0.01)，見(jiàn)圖 3、4。

3 討 論

骨的重建由骨的生成和吸收構(gòu)成，成骨細(xì)胞具有骨的形成功能，破骨細(xì)胞具有骨吸收作用。兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡是維持正常骨量的關(guān)鍵［5］。成骨細(xì)胞是骨形成、生長(zhǎng)、發(fā)育的重要細(xì)胞之一，其起源于多功能骨髓基質(zhì)的間質(zhì)細(xì)胞，在骨形成過(guò)程中歷經(jīng)分裂增殖、分化成熟和基質(zhì)鈣化三個(gè)階段。其中任何一個(gè)階段出現(xiàn)異常時(shí)，都會(huì)對(duì)骨量和骨的組成產(chǎn)生重要的影響。目前有關(guān)膽固醇與骨密度關(guān)系的研究結(jié)果存在有分歧。既往的大量研究表明LDL水平與骨密度呈負(fù)相關(guān)［6-7］，本次研究發(fā)現(xiàn)LDL在24 h濃度為0.05 mg/ml時(shí)，明顯抑制成骨細(xì)胞的增殖，LDL對(duì)成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用在一定程度上呈LDL劑量及作用時(shí)間依賴(lài)性。LDL作用時(shí)間為48 h，濃度為0.20 mg/ml時(shí)，對(duì)該株細(xì)胞增殖的抑制作用最大，抑制率為63.48%。Brodeur等發(fā)現(xiàn)，10～50 μg/ml的ox-LDL促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，而150 μg/ml濃度以上的ox-LDL可殺死細(xì)胞，其機(jī)制與ox-LDL引發(fā)的溶酶體膜損傷有關(guān)［8］。Klein發(fā)現(xiàn)，LDL和ox-LDL可誘導(dǎo)Saos2成骨細(xì)胞凋亡，LDL可抑制Akt及其下游基因FKHR和GSK3的磷酸化，同時(shí)LDL可上調(diào)促凋亡基因Bcl-Xs和下調(diào)抗凋亡 Src激酶活性［9］。Brodeur等也發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡，證明LDL在成骨細(xì)胞中具有多重功能。

骨鈣素(OC)又稱(chēng)骨γ-羥基骨蛋白(BGP)或骨依賴(lài)維生素K蛋白，是由成骨細(xì)胞及肥大細(xì)胞合成分泌的一種小分子蛋白，含49個(gè)氨基·酸殘基，分子質(zhì)量5.8 kD。血清中OC水平變化直接反映成骨細(xì)胞活性，體外研究顯示OC為成熟骨細(xì)胞的標(biāo)志物，當(dāng)骨組織礦化和成骨細(xì)胞分化增加時(shí)，OC也隨之特異增加［10］。本次研究發(fā)現(xiàn)在24 h、濃度為0.05 mg/ml LDL明顯抑制成骨細(xì)胞中的骨鈣素表達(dá)，隨著LDL濃度和作用時(shí)間的增加，抑制作用不斷增強(qiáng)，說(shuō)明LDL抑制成骨細(xì)胞中骨鈣素的表達(dá)，證明LDL均參與調(diào)節(jié)了成骨細(xì)胞的分化。Taylor等發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可與β-磷酸甘油協(xié)同作用誘導(dǎo)小牛主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分化，其機(jī)制可能與Osterix與Msx2基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)［11］。體外實(shí)驗(yàn)中，采用輕度氧化LDL或其他活性氧化脂質(zhì)處理骨髓中前成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物，如骨鈣素等受到抑制;而前成骨細(xì)胞則在氧化脂質(zhì)的誘導(dǎo)下向脂細(xì)胞分化;兔血清、脂肪酸和LDL氧化產(chǎn)物也能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞系向脂肪樣細(xì)胞分化［12］。

經(jīng)典Wnt通路可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化、骨基質(zhì)的形成及礦化等環(huán)節(jié)并可影響破骨細(xì)胞的發(fā)生和骨吸收［13-14］。大量研究顯示LRP5可通過(guò)Wnt/LRP5/β-連環(huán)蛋白途徑直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能及骨量［15-16］。抑制劑Dickkopf-1是由細(xì)胞內(nèi)分泌的內(nèi)源性蛋白質(zhì)或生物活性物質(zhì)［17］，它可通過(guò)作用于Wnt信號(hào)通路的上游分子卷曲蛋白和散亂蛋白起作用，從而產(chǎn)生拮抗Wnt通路的作用。目前確認(rèn)的DKKl受體有低密度脂蛋白受體(LRP-5與LRP-6)［18］及含 kringle 結(jié)構(gòu)域的 Kremen 蛋白受體［19］。DKK1直接與LRP受體結(jié)合，或者與其跨膜受體Kremen(Kremen-1，Kremen-2)結(jié)合后再與LRP5/6結(jié)合形成三聚體，誘導(dǎo)快速的細(xì)胞內(nèi)吞，減少細(xì)胞膜上的LRP5/6，由此阻斷了Wnt信號(hào)向胞內(nèi)的傳遞［20］，使骨形成減少。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)過(guò)度表達(dá)的DKK1能抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，使成骨細(xì)胞數(shù)量減少，還能抑制骨基質(zhì)的礦化及骨折后的修復(fù)［21-22］。

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在LDL在24 h濃度為0.05 mg/ml時(shí)明顯下調(diào)成骨細(xì)胞中的LRP5 mRNA表達(dá)水平，顯著上調(diào)DKK1 mRNA表達(dá)水平，提示HDL和LDL對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的抑制作用可能與 wnt信號(hào)通路 LRP5及其抑制劑DKK1的表達(dá)有一定關(guān)系。

［1］Makovey J，Chen JS，Hayward C，et al.Association between serum cholesterol and bone mineral density［J］.Bone，2009，44(2):208 －213.

［2］Buizert PJ，van Schoor NM，Lips P，et al.Lipid levels:a link between cardiovascular diseaseand osteoporosis?［J］.J Bone Miner Res，2009，24(6):1103－1109.

［3］D'Amelio P，Di Bella S，Tamone C，et al.HDL cholesterol and bone mineral density in normal-weight postmenopausal women:is there any possible association?［J］.Panminerva Med，2008，50(2):89 －96.

［4］Dennison EM，Syddall HE，Aihie Sayer A，et al.Lipid profile，obesity and bone mineral density:the hertfordshire cohort study［J］.QJM，2007，100(5):297－303.

［5］唐泉，孫元明.經(jīng)典Wnt信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的影響［J］.天津醫(yī)藥，2012，40(2):187－189.

［6］尤婷婷，吳鐵，張志平，等.高脂血癥致大鼠骨質(zhì)疏松作用研究初探［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12(3):299－303.

［7］Orozco P.Ath erogenic lipid profile and elevated lipoprotein(a)are associated with lower bone mineral density in early postmenopausal overweight women［J］.Eur J Epidemio，2004，19(12):1105 －1112.

［8］Brodeur MR，Brissette L，F(xiàn)alstrault L，et al.Influence of oxidized low-density lipoproteins(LDL)on the viability of osteoblastic cells［J］.Free Radic Biol Med，2008，44(4):506 －517.

［9］Klein BY，Kerem Z，Rojansky N.LDL induces Saos2 osteoblasts death via Akt pathways responsive to a neutral sphingomyelinase inhibitor［J］.J Cell Biochem，2006，98(3):661 －671.

［10］劉紅，廖二元，伍賢平.骨鈣素與代謝性骨?。跩］.國(guó)外醫(yī)學(xué):內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè)，2004，24(4):239－240.

［11］Taylor J，Butcher M，Zeadin M，et al.Oxidized lowdensity lipoprotein promotes osteoblast differentiation in primary cultures of vascular smooth muscle cells by upregulatingosterixExpression in an Msx2-Dependent manner［J］.J Cell Biochem，2011，112(2):581 －588.

［12］Parhami F，Morrow AD，Balucan J，et al.Lipid oxidation products have opposite effects on calcifying vascular cell and bone cell differentiation.A possible explanation for the paradox of arterial calci fication in osteoporotic patients［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17(4):680 －687.

［13］BenneR CN， Longo KA， wrightWS， eta1.Regulation of esteoblastogenesis and bone mass by Wntlob［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(9):3324－3329.

［14］Yu HM，Jerchow B，Sheu TJ，et a1.The role of Axin2 in calvarial morphogenesis and craniosynostosis［J］.Development，2005，132(8):1995 －2005.

［15］Van wL，Cleiren E，Gram J.Six novel missense mutations in the LDL recepter-related protein 5(LRP5)gene in different conditions with increased bone density［J］.Am J Hum Genet，2003，72(3):763 －771.

［16］Qiang YW，Hu B，Chen Y，et al.Bortezomib induces osteoblast differentiation via Wnt-independent activation of beta-catenin/TCFsignaling［J］.Blood，2009，113(18):4319－4330.

［17］Kawano Y，Kypta R.Secreted antagonists of the Wnt signaling pathway［J］.J Cell Sci，2003，116(13):2627－2634.

［18］Mao B，Wu w，Li Y，et a1.LDL-receptor-related protein 6 is a receptor for dickkopf proteins［J］.Nature，2001，411:321 －325.

［19］Mao B，Wu W，Davidson G，et a1.Kromen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/beta-catenin signalling［J］.Nature，2002，417:664 －667.

［20］Mikheev AM，Mikheeva SA，Rostomily R，et a1.Dickkopf-1 activatescelldeath in MDA-MB435 melanoma cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，352(3):675 －680.

［21］Amantea CM，Kim WK，Meliton V，el a1.Oxysterel induced estoogenic differentiation of marrow stromal cells is regulated by Dkk-l inhibitable and P13-kinase mediated signaling［J］.J Cell Bioohem，2008，105(2):424－436.

［22］Lia J，Sarosib I，Russell C，et al.Dkkl mediated inhibition of Wnt signaling in bone results in esteopenia［J］.Bone，2006，39(4):754 －766.