張慧珠 劉淑梅 白 靜 張博男 勾向博

順鉑（cisplatin，CP）是一種廣譜抗腫瘤藥物，對(duì)多種實(shí)體瘤具有良好的治療作用。但其嚴(yán)重的不良反應(yīng)，包括腎損害、胃腸道損害、骨髓抑制、耳毒性和肝毒性等，大大限制了其在臨床的應(yīng)用。廣泛深入地研究CP的組織損傷機(jī)制，對(duì)于預(yù)防和減輕其不良反應(yīng)具有重要意義。以往研究認(rèn)為CP的毒性與氧化應(yīng)激、炎癥、基因損傷及細(xì)胞周期抑制等有關(guān)[1-2]，故推論抗氧化劑對(duì)其毒性應(yīng)具有一定抑制作用。本研究選取具有較強(qiáng)抗氧化作用的葉黃素（lu?tein，LU）作為干預(yù)藥物，觀察其對(duì)CP損傷大鼠肝組織及肝超微結(jié)構(gòu)的影響，為臨床防治CP肝毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雌性SD大鼠24只，平均體質(zhì)量（160.6±15.5）g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證編號(hào)：SCXK（京）2009-0004，合格證號(hào)0168693。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為生理鹽水組（NS組）、CP組和葉黃素預(yù)防組（LU+CP組），每組8只。

1.1.2 儀器及試劑 注射用順鉑（批號(hào)09010201），山東羅欣藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，臨用前用生理鹽水配制成1 g/L；葉黃素（批號(hào)20100325，葉黃素含量88.6%），北京禹光生物科技公司產(chǎn)品，臨用前用玉米油溶解，質(zhì)量濃度為20 g/L。CHD型光學(xué)顯微鏡（日本，Olympus）；圖像采集及圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)，Bio-Rad）。H7650型透射電鏡（日本，Hitachi）。

1.2 方法 動(dòng)物喂養(yǎng)及處理 各組大鼠均采用基礎(chǔ)飼料，同條件喂養(yǎng)。NS組每天灌服玉米油2 mL/kg，7 d后腹腔注射生理鹽水5 mL/kg；CP組每天灌服與NS組等量的玉米油，7 d后一次性腹腔注射1 g/L的CP 5 mL/kg；LU+CP組每天灌胃20 g/L的LU油溶液2 mL/kg，7 d后一次性腹腔注射與CP組等量的CP。各組注射生理鹽水或CP后繼續(xù)灌服玉米油或葉黃素4 d，第5天各組大鼠斷頭處死并剖取肝臟。

1.3 觀察指標(biāo) 肝臟病理結(jié)構(gòu)觀察 取2 mm×2 mm×2 mm肝左葉尖部于10%福爾馬林中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察腎臟病理結(jié)構(gòu)的改變。

1.4 肝臟超微結(jié)構(gòu)觀察 取1 mm×1 mm×1 mm肝左葉尖部于2.5%戊二醛固定，經(jīng)0.1%磷酸緩沖液漂洗3次，以1%鋨酸固定，經(jīng)過(guò)50%、70%、90%、100%丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂618與環(huán)氧丙烷（1∶1）浸透1 h，純包埋液浸透2 h，純包埋液固化（37℃24 h，60℃48 h），超薄切片。經(jīng)過(guò)醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，用透射電鏡觀察大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)變化并攝片。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肝臟病理圖比較 NS組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，正常肝細(xì)胞為較大的多邊形細(xì)胞，胞核為圓形。細(xì)胞質(zhì)嗜酸性較強(qiáng)，肝血竇圍繞肝小葉中心與整齊排列的肝索間隔排列，見(jiàn)圖1a。CP組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞質(zhì)多呈現(xiàn)空泡，細(xì)胞萎縮，肝門(mén)管區(qū)有較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及少量纖維組織增生，見(jiàn)圖1b。LU+CP組大鼠肝損傷明顯減輕，細(xì)胞排列整齊，只有少數(shù)細(xì)胞有空泡，肝門(mén)管上皮細(xì)胞纖維化作用明顯減輕，見(jiàn)圖1c。

Figure 1 Light microscopic images of HE-stained rat liver tissues(×200)圖1 大鼠肝組織HE染色切片光鏡照片（×200）

2.2 3組大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)圖比較 NS組大鼠肝細(xì)胞呈多邊形，膜相結(jié)構(gòu)界限清楚，厚薄均勻?；|(zhì)豐富，呈中等電子密度。細(xì)胞質(zhì)中布滿(mǎn)細(xì)胞器，線(xiàn)粒體圓形或橢圓形，嵴正常而清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)并呈層狀分布，可見(jiàn)糖原。細(xì)胞核圓形，常染色質(zhì)多，核仁清楚。血竇面肝細(xì)胞微絨密集，貯脂細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大小不等的脂滴，見(jiàn)圖2a、b。CP組肝細(xì)胞基質(zhì)疏松，出現(xiàn)空泡，細(xì)胞器明顯減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列紊亂，呈現(xiàn)片層結(jié)構(gòu)，線(xiàn)粒體萎縮或腫脹，嵴斷裂或消失。細(xì)胞核固縮，異染色質(zhì)明顯增加、濃縮邊集，有些可見(jiàn)凋亡小體；膽小管擴(kuò)張，見(jiàn)圖2c、d、e、f。LU+CP組肝損傷明顯輕于CP組，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有少量空泡化改變，程度較輕。伴有輕度的線(xiàn)粒體腫脹，嵴結(jié)構(gòu)模糊。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，肝細(xì)胞核內(nèi)雖然也可見(jiàn)異染色體增加和邊集，但與CP組大鼠肝細(xì)胞比較，其超微結(jié)構(gòu)的病理性改變明顯減輕，見(jiàn)圖2g、h。

Figure 2 The ultrastructure of rat liver tissues by electron microscopy圖2 大鼠肝組織超微電鏡圖

3 討論

CP在肝臟的蓄積量?jī)H次于腎臟，故高劑量CP常會(huì)導(dǎo)致肝損害[3]。本研究采用一次性腹腔注射CP 5 mg/kg的方法，造成大鼠急性肝損傷的模型。肝組織切片檢查發(fā)現(xiàn)大鼠肝組織出現(xiàn)空泡、壞死、炎性浸潤(rùn)、門(mén)靜脈周?chē)w維化及肝索結(jié)構(gòu)明顯被破壞等病理變化。透射電鏡顯示細(xì)胞核固縮，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，呈片層狀，線(xiàn)粒體出現(xiàn)腫脹或萎縮，嵴結(jié)構(gòu)被破壞，甚至出現(xiàn)空泡改變，進(jìn)一步證明了CP對(duì)肝組織的損傷。研究認(rèn)為，CP對(duì)細(xì)胞的殺傷作用主要是通過(guò)形成DNA加成物，導(dǎo)致細(xì)胞停留于細(xì)胞周期的G2期而觸發(fā)細(xì)胞凋亡[4]。此外，在酒精性肝纖維化大鼠中，誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450 2E1可通過(guò)氧化應(yīng)激作用使纖維化作用加強(qiáng)[5]。這是因?yàn)榧?xì)胞色素P450 2E1主要在肝臟表達(dá)，與其他類(lèi)型的細(xì)胞色素P450不同，其與NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶結(jié)合不緊密，CYP 2E1顯示出很強(qiáng)的NADPH氧化酶活性，可產(chǎn)生大量的超氧化物陰離子自由基（O2-）和過(guò)氧化物，在鐵催化劑存在的情況下可產(chǎn)生更強(qiáng)的氧化劑如羥自由基（OH-）。故誘導(dǎo)CYP 2E1，可增強(qiáng)鐵和多不飽和脂肪酸引起的肝臟毒性。CP肝毒性可因細(xì)胞色素P450 2E1的過(guò)度表達(dá)而增強(qiáng)[6]，故其誘導(dǎo)的氧自由基產(chǎn)生增加及氧化應(yīng)激作用參與了肝損傷。因此，具有抗氧化作用的物質(zhì)對(duì)CP導(dǎo)致的肝損傷均可表現(xiàn)一定的保護(hù)作用，如硒和高劑量維生素E口服可保護(hù)肝臟免受CP所導(dǎo)致的氧化損傷[7]；血紅素氧化酶及過(guò)氧化氫酶在CP對(duì)荷瘤小鼠的肝損傷過(guò)程中均起一定保護(hù)作用[8]；降低還原型谷胱甘肽（GSH）水平可使CP對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞毒性增加，而GSH的前體L-半胱氨酸則可起保護(hù)作用[9]。其他具有抗氧化作用的中藥單體如水飛薊素[10]、硒和?；撬岬萚11]對(duì)CP導(dǎo)致的肝損傷均具有保護(hù)作用。

葉黃素是廣泛存在于植物中的一種類(lèi)胡蘿卜素，由2個(gè)六元碳環(huán)經(jīng)1個(gè)含十八碳原子的共軛雙鍵長(zhǎng)鏈聯(lián)接形成，屬于脂溶性植物色素。由于其結(jié)構(gòu)中共軛雙鍵的存在，使其能夠淬滅單線(xiàn)態(tài)氧，從而抑制具有破壞性的自由基的形成。除了可用于預(yù)防老年性黃斑區(qū)病變，對(duì)多種氧化應(yīng)激性疾病如衰老[12]、癌癥[13]及糖尿病性組織病變[14]等均可有防治作用。

本研究將大鼠用LU預(yù)處理后再給予大劑量CP，光鏡下可見(jiàn)大鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝索結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞空泡明顯減少，肝門(mén)管區(qū)纖維化作用減輕。電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核異染色質(zhì)減少，線(xiàn)粒體損傷減輕。從形態(tài)結(jié)構(gòu)顯示了葉黃素對(duì)CP所導(dǎo)致的肝損傷具有保護(hù)作用。證明了LU預(yù)處理可減輕CP導(dǎo)致的肝毒性作用。

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