郜 巒，王 鍵△，胡建鵬，何 玲，菅 威，唐 巍，王曉戎

(1.安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230038;2.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽蕪湖 241000)

腦血管病是威脅人類健康的三大疾病之一，以其發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致殘率高、死亡率高的特點(diǎn)給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)，綜述表明，在發(fā)達(dá)國家，中風(fēng)是第三個(gè)最常見的死亡原因，也是成年中致殘的最主要原因，帶來了極重的社會負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。其中，缺血性腦卒中最為多見，卒中后智力障礙與肢體致殘是一嚴(yán)重的社會問題和醫(yī)學(xué)難題。因此，研究如何促進(jìn)神經(jīng)再生，重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，修復(fù)損傷的腦組織，從而提高患者的生活質(zhì)量，有著十分重大的意義。隨著腦缺血研究的不斷深入，中醫(yī)藥的防治日益得到醫(yī)學(xué)界的重視。多年來，我們課題組一直從事中醫(yī)藥防治中風(fēng)治則治法研究，較好地闡明了名老中醫(yī)王樂匋教授所創(chuàng)立的益氣活血法及其代表方劑腦絡(luò)欣通的神經(jīng)保護(hù)作用。本次研究擬選用大腦中動(dòng)脈線栓法制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，觀察局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶PI3K/AKT通路的動(dòng)態(tài)表達(dá)及益氣活血方藥對其影響，探討其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD大鼠120只，體重280～320g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號:SCXK(皖)2011－002，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)觀察3d。

1.2 藥物與試劑

益氣活血法方組藥物為腦絡(luò)欣通 (由黃芪、川芎、當(dāng)歸、三七、蜈蚣等組成)，益氣法組藥物為黃芪，活血法組方為川芎、當(dāng)歸、三七、蜈蚣等構(gòu)成。PI3K/AKT試劑盒、DAB顯色劑均由武漢博士德生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器

T3－200型分析天平:成都科學(xué)儀器廠。101－A恒溫干燥箱:寧波自動(dòng)化儀表廠。石蠟包埋機(jī):英國HIS2TOCENTRE公司。石蠟切片機(jī):英國FINESSE公司。OLYMPUS VANOX顯微鏡。

2 方法

2.1 分組方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、益氣活血法方組 (腦絡(luò)欣通組)、益氣法方組、活血法方組。每組再分為缺血再灌注 3d，7d，14d 3個(gè)亞組。

2.2 模型制作方法

參考Longa大腦中動(dòng)脈線栓法改良制作局灶性腦缺血再灌注動(dòng)物模型。動(dòng)物稱重后，以10%水合氯醛 (0.36mL/100g體重)麻醉大鼠，頸前術(shù)區(qū)脫毛、消毒，沿頸部正中線切開皮膚，逐層分離暴露頸總、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，從近心端做切口置入直徑為0.25mm尼龍線，(頭端加熱成直徑約0.30mm的圓球形)由頸外向頸內(nèi)插入約18～20mm，感覺少許阻力為止，阻斷大腦中動(dòng)脈血流，逐層縫合切口。缺血2h后再灌注時(shí)，將尼龍線拔出約10mm。模型成功的標(biāo)志為出現(xiàn)同側(cè)Horner征和對側(cè)前肢為重的偏癱。假手術(shù)組只分離，不插入尼龍線。

2.3 給藥方法

益氣方、活血方、益氣活血方由安徽中醫(yī)學(xué)院中藥制劑室制備成湯劑，根據(jù)以往藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，益氣、活血、益氣活血組分別按 3.5g/kg、5.04g/kg、8.54g/kg(即 1.42mL/kg，1.56 mL/kg，1.34 mL/kg)，每日總劑量分早晚2次灌胃使用。假手術(shù)組及模型組按同樣方法予以等量生理鹽水灌胃。給藥時(shí)間分別為3d，7d，14d。

2.4 取材方法

每組動(dòng)物均于缺血2h再灌注，分別于腦缺血再灌注3d，7d，14d后麻醉大鼠，打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導(dǎo)管至主動(dòng)脈，向主動(dòng)脈內(nèi)緩慢注入37℃肝素化的生理鹽水200mL，至右心房流出液變清亮，注入4%多聚甲醛溶液250mL進(jìn)行內(nèi)固定，然后立即取出大腦，正中割開，置于4%多聚甲醛溶液中固定。固定1周脫水、透明、浸蠟，連續(xù)腦部冠狀切片。

2.5 指標(biāo)檢測方法

PI3K、AKT指標(biāo)均用免疫組織化學(xué)SABC法測定，均由專業(yè)人員嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用南京捷達(dá)801圖像分析系統(tǒng)對PI3K、AKT免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞平均吸收光密度進(jìn)行圖像分析，取平均值。數(shù)據(jù)用 ()表示 ，用SPSS13.0 for Windows軟件處理，采用方差分析。

3 結(jié)果

表1 不同時(shí)間點(diǎn)益氣活血法對PI3K影響

表2 不同時(shí)間點(diǎn)益氣活血法對AKT影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，模型組和假手術(shù)比較，PI3K、AKT表達(dá)增加。其中缺血再灌注7d，14d，模型組PI3K表達(dá)顯著高于假手術(shù)組。和模型組比較，益氣組、活血組、益氣活血組PI3K、AKT表達(dá)均增加。其中，活血組在腦缺血再灌注14d，能夠明顯增加PI3K、AKT的表達(dá)。益氣活血組在腦缺血再灌注3d，7d，14d，能夠明顯增加PI3K、AKT的表達(dá)。

組間比較顯示，益氣活血組在腦缺血再灌注14d，能夠明顯增加PI3K、AKT的表達(dá)，顯著優(yōu)于益氣組和活血組。而活血組在腦缺血再灌注14d，能夠明顯增加 PI3K、AKT的表達(dá)，顯著優(yōu)于益氣組。

4 討論

腦缺血再灌注損傷是一個(gè)涉及多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的過程，目前尚缺乏治療特效的藥物和方法，已有的研究表明中醫(yī)理論指導(dǎo)下的中醫(yī)藥及針灸療法都具有整體良性調(diào)節(jié)作用［2－3］。我們課題組在既往的研究中，從形態(tài)學(xué)、血液流變學(xué)、凝血和纖溶、興奮性氨基酸、自由基損傷、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)、神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系、細(xì)胞凋亡及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖分化等環(huán)節(jié)，對益氣活血法及其代表方劑腦絡(luò)欣通進(jìn)行了多角度研究，已證實(shí)了其具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。

近年的研究表明，PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是重要的細(xì)胞存活信號通路，在多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞生存中發(fā)揮重要作用［4］。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidy1inosito1－3 kinase，PI3K)是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶，參與細(xì)胞的生長代謝、增殖分化及凋亡等多種生物過程。在神經(jīng)系統(tǒng)中，PI3K參與神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生存和分化。PI3K的主要下游信號分子是AKT，又稱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。活化的PI3K催化產(chǎn)生PI－3，4－P2和PIP3，后者誘導(dǎo)無活性的AKT和磷脂酰肌醇依賴的激酶－l轉(zhuǎn)位至漿膜內(nèi)表面，從而實(shí)現(xiàn)AKT的激活，通過AKT的活化引起下游靶基因的變化［5－6］。近年來，更有學(xué)者日漸重視其在神經(jīng)干細(xì)胞中的作用。如有研究提示神經(jīng)干細(xì)胞存活依賴于PI3K/AKT途徑的活化［7］。另有學(xué)者應(yīng)用 PI3K特異性阻滯劑LY294002孵育大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，探討PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在NSCs中的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對大鼠NSCs的存活、增殖、分化起重要作用，且LY294002對NSCs的存活、增殖和分化的影響呈劑量依賴性［8］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，模型組和假手術(shù)比較，PI3K、AKT表達(dá)增加。PI3K/Akt信號通路是細(xì)胞的凋亡過程中的一條重要存活通路，腦缺血再灌注發(fā)生后，PI3K/Akt信號通路激活，起到神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，益氣活血組能夠明顯激活PI3K/AKT信號通路，且顯著優(yōu)于益氣組和活血組。而組間的比較還顯示，活血組在腦缺血再灌注14d，能夠明顯增加PI3K、AKT的表達(dá)，顯著優(yōu)于益氣組。提示益氣藥物可能需配合活血方法一起使用，才能顯示其最佳療效。實(shí)驗(yàn)表明，益氣活血法腦保護(hù)作用的可能機(jī)制是上調(diào)細(xì)胞存活信號通路PI3K/Akt通路的表達(dá)，從而對腦缺血模型大鼠腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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