王少敏， 胡 青， 季 申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203)

丹香冠心注射液是一種常用的中藥注射液，具有活血化瘀，理氣開竅的功能，臨床用于冠心病、心絞痛、心肌梗死屬瘀血閉阻證等。其不良反應(yīng)主要為過(guò)敏反應(yīng)，如靜滴時(shí)引起頭痛、藥疹、藥物熱、皮膚瘙癢等，少量嚴(yán)重不良反應(yīng)為靜脈炎和過(guò)敏性休克、呼吸困難、喉水腫。為明確丹香冠心注射液的組成成分以進(jìn)一步控制質(zhì)量安全，對(duì)其進(jìn)行物質(zhì)基礎(chǔ)研究成為必要。

中藥注射液是一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)，物質(zhì)成分眾多，類別多樣，性質(zhì)差異大，大量成分含量低。傳統(tǒng)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究方式多采用色譜吸附分離技術(shù)得到純度高的單體化合物后，再獲取光譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。該方法需要大量的人力物力，耗時(shí)長(zhǎng)，分離鑒定含量低的成分難度大。近年來(lái)，色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)發(fā)展迅速，如氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC－MS)可用于實(shí)現(xiàn)揮發(fā)油成分快速分離定性，而液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)則是研究中藥中非揮發(fā)性成分的重要手段，其中超高效液相-四級(jí)桿/飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q/TOF-MS)技術(shù)具備分析速度快、高靈敏度、準(zhǔn)確質(zhì)量和全譜記錄等特點(diǎn)，可以提供準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)、碎片信息和可能結(jié)構(gòu)，對(duì)于未知化合物的鑒定是強(qiáng)有力的工具［1］。

丹香冠心注射液處方由丹參、降香兩味藥組成，主要工藝為丹參水提醇沉酸堿除雜，降香水蒸氣蒸餾揮發(fā)油，二者合并。根據(jù)工藝推測(cè)，最終產(chǎn)品中應(yīng)含有丹參水溶性成分和降香的揮發(fā)性成分。本實(shí)驗(yàn)分別采用GC/MS和UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)，對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

美國(guó)安捷倫公司Agilent 6890N GC/5973N MSD氣相質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀;MSD Chemistation D 03.00.611數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);美國(guó)Waters Acquity@ 超高效液相譜儀色譜儀;美國(guó) Micromass Synapt Q-TOF-MS(四級(jí)桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜儀);Epppendorf 5810R臺(tái)式離心機(jī)。甲醇、乙腈為色譜純，由Fluca公司提供，石油醚、乙酸乙酯為農(nóng)殘級(jí)純，由Merck公司提供，

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):反式 －苦橙油醇對(duì)照品(批號(hào):0001421969，Sigma公司);降香揮發(fā)油對(duì)照品(批號(hào):111579-200201);丹參素鈉(批號(hào):110855-200203);原兒茶醛(批號(hào):110810-200205);丹酚酸 B(批號(hào):111562-200302);原兒茶酸(批號(hào):809-200102)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

丹香冠心注射液:批號(hào):0909025、091003、0911083、0912048、0912065、1001036、1002019、1002060、1003035、1003054(生產(chǎn)企業(yè) A:上海中西制藥有限公司);批號(hào):090508、090510、090720、090812、090917、091101、091107、091222、100304、100306(生產(chǎn)企業(yè)B:上海新亞藥業(yè)高郵有限公司)。

2 溶液的制備

2.1 對(duì)照品溶液的制備

2.1.1 GC－MS對(duì)照品溶液 取降香揮發(fā)油和反式－苦橙油醇對(duì)照品適量，分別加乙酸乙酯制成每1 mL含0.1 mg的對(duì)照品溶液。

2.1.2 UPLC-Q/TOF-MS對(duì)照品溶液的制備 取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、原兒茶酸等對(duì)照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 GC－MS供試品溶液 取丹香冠心注射液10 mL，置具塞試管加入2 mL石油醚，渦旋2 min，靜置，待分層后，取上清液，備用，下層溶液中加入2 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，靜置，待分層后，取上清液，石油醚液與乙酸乙酯溶液作為不同極性部位供試品溶液進(jìn)行分析。同時(shí)不取樣品溶液，按上述方法，制備相應(yīng)隨行空白溶液。

2.2.2 UPLC-Q/TOF-MS供試品溶液 取丹香冠心注射液，過(guò)0.22 μm的濾膜，取續(xù)濾液，即得。

3 色質(zhì)聯(lián)用條件

3.1 GC-MS條件 色譜柱:Agilent Innowax毛細(xì)管色譜柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);升溫程序:初始溫度100℃，以2℃/min的速率升溫至200℃并保持5 min，載氣:氦氣，體積流量1.2 mL/min;分流比1∶1;進(jìn)樣體積1 μL;進(jìn)樣口溫度:280℃;氣質(zhì)接口溫度:250℃;電離方式:電子轟擊(E I);電離能量:70 eV;掃描質(zhì)量范圍:30～600 AMU;掃描間隔:0.5 s。

3.2 UPLC-Q/TOF-MS 條件 UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm ×50 mm);流動(dòng)相 A 為乙腈，B為0.01%甲酸溶液，體積流量0.3 mL/min;柱溫25℃;進(jìn)樣量10 μL。采用以下兩種梯度洗脫程序分別對(duì)應(yīng)Q/TOF-MS的正、負(fù)離子檢測(cè)模式:①0～30 min，5%→30%A;30 ～60 min，30%→50%A，60 ～90 min，50%→70%A，90 ～100 min，70%→95%A;100～110 min 5%A;②:0 ～5 min，5%A;5 ～90 min，5%→22%A，90 ～95 min，22%→95%A，95 ～100 min，5%A。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI);采用正、負(fù)離子兩種模式檢測(cè)，毛細(xì)管電壓為3200 V，錐孔電壓為35 V，檢測(cè)器電壓為2000 V;脫溶劑氣流為600 L/h，脫溶劑氣流為350℃，錐孔氣流量為50 L/h，離子源溫度為120℃，0.2 s采集一次譜圖;質(zhì)量校正液(Lockspay)為亮氨酸-腦啡肽(leucine－enkephalin，［M+H］+=556.2771，［M － H］－=554.2615)，質(zhì)量掃描范圍:m/z 50 ～900。

4 結(jié)果

4.1 揮發(fā)性物質(zhì) 對(duì)2個(gè)廠家的20批樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果各廠家生產(chǎn)的10批樣品圖譜基本一致，結(jié)合所有供試品溶液總離子流圖譜，扣除相應(yīng)的隨行溶劑空白中的干擾峰，共檢出25個(gè)色譜峰，見圖1。對(duì)相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%的19個(gè)峰進(jìn)行質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，經(jīng)與Nist數(shù)據(jù)庫(kù)和對(duì)照品匹配，鑒定出反式－苦橙油醇等6個(gè)化合物，另13個(gè)化合物經(jīng)推斷均為苦橙油醇系列衍生物，其中12個(gè)化合物組成了三組同分異構(gòu)體。按各色譜峰的質(zhì)譜裂片圖與文獻(xiàn)核對(duì)［2-6］，對(duì)基峰、質(zhì)荷比和相對(duì)豐度等方面進(jìn)行直觀比較，分別對(duì)各個(gè)色譜峰加以確認(rèn)，綜合各項(xiàng)分析鑒定，其中第一組同分異構(gòu)體:峰5，7，11，12，20(保留時(shí)間為 32.6 min，33.5 min、41.2 min、41.7 min、46.5 min)的質(zhì)譜圖與文獻(xiàn)報(bào)道的氧化苦橙油醇一致，推斷該5個(gè)色譜峰為氧化苦橙油醇5個(gè)同分異構(gòu)體。第二組同分異構(gòu)體由峰3，4，6，8，14(保留時(shí)間分別為 31.9 min、32.3 min、32.8 min、33.6 min、43.2 min)組成，對(duì)其質(zhì)譜裂片信息進(jìn)行解析，推測(cè)其可能結(jié)構(gòu)為氧化苦橙油醇的一個(gè)氫原子被羥基取代。第三組同分異構(gòu)體:峰13和峰15(保留時(shí)間分別為42.7 min、44.2 min)的質(zhì)譜圖中具有與第二組相似的裂片:m/z 55.1，m/z 70.0，m/z 125.1，m/z 195.2，而峰 18(保留時(shí)間為 46.0 min)則具有與第三組相似的裂片信息:m/z 55.1，m/z 70.0，m/z 111.1，m/z 125.1，m/z 195.2，說(shuō)明其均為結(jié)構(gòu)相似的苦橙油醇系列化合物，見表1和圖1～2。

圖1 對(duì)照品及丹香冠心注射液樣品GC/MS總離子流圖Fig.1 GC/MS ion chromatograms of reference substances and Danxiang Guanxin Injetion

4.2 水溶性成分 同一廠家生產(chǎn)的10批樣品圖譜基本相似，丹香冠心注射液中水溶性成分主要為來(lái)自丹參中的酚酸類物質(zhì)，在負(fù)離子模式下容易帶電荷，另外，為保證某些成分在正離子模式下響應(yīng)較好，質(zhì)譜上分別對(duì)負(fù)離子和正離子兩種模式進(jìn)行采集，獲得的化合物相互進(jìn)行補(bǔ)充，按3.2項(xiàng)分析條件，繪制UPLC/Q-TOF-MS BP I正、負(fù)離子掃描總離子流圖，見圖3。根據(jù)部分標(biāo)準(zhǔn)品定位和文獻(xiàn)進(jìn)行鑒定［7-12］，結(jié)果負(fù)離子模式中響應(yīng)峰較多，鑒別出24個(gè)化合物，正離子模式中鑒別出6個(gè)化合物，其中5個(gè)已在負(fù)離子質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)，故共鑒定了圖譜中的25個(gè)主要色譜峰，見圖3和表2。

表1 丹香冠心注射液中揮發(fā)性成分Tab.1 The volatile compounds in Danxiang Guanxin Injection

圖2 反式－苦橙油醇對(duì)照品及系列衍生物GC/MS質(zhì)譜裂片圖Fig.2 GC/MS fracture ion chromatograms of reference substances and it’s derivatives

圖3 丹香冠心注射液的UPLC/Q-TOF-MS總離子流圖(正、負(fù)離子模式)Fig.3 UPLC/Q-TOF-MS total ion chromatograms of reference substances and Danxiang Guanxin Injetion

表2 丹香冠心注射液水溶性成分Tab.2 The water-soluble compounds in Danxiang Guanxin Injection

(續(xù)表2)

5 討論

5.1 為完全提取不同極性的揮發(fā)性成分，采用石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇不同溶劑依次提取丹香冠心注射液樣品，結(jié)果表明三氯甲烷、正丁醇部位總離子流圖中基本無(wú)色譜峰，說(shuō)明石油醚和乙酸乙酯已基本將揮發(fā)性成分完全提取。

5.2 對(duì)非極性和極性兩種氣相色譜柱進(jìn)行了考察，并配以相適應(yīng)的升溫程序，① HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);梯度升溫程序?yàn)槌跏?0℃，保持10 min，以5℃/min升至280℃;② Agilent Innowax 毛細(xì)管色譜柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);梯度升溫程序?yàn)槌跏?00℃，以2℃/min升至200℃，保持5 min。結(jié)果后者對(duì)色譜峰分離度更好，選擇柱②進(jìn)行分析。

5.3 對(duì)UPLC色譜條件進(jìn)行了考察，采用不同填料(C18和T3硅膠)、不同長(zhǎng)度(50 mm，100 mm，150 mm)的3根色譜柱進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果以C18填料、柱長(zhǎng)50 mm的UPLC色譜柱得到的譜圖中色譜峰多且分離度好。以乙腈-0.01%甲酸溶液為流動(dòng)相體系，進(jìn)行梯度洗脫，乙腈由5%變化至95%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)因樣品中水溶性成分主要為酚酸類，極性較強(qiáng)，多出現(xiàn)在5%～40%乙腈比例，故最終確定以較低乙腈比例的流動(dòng)相體系進(jìn)行洗脫，使各化合物分離良好。

5.4 對(duì)目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的丹香冠心注射液進(jìn)行了收集，發(fā)現(xiàn)目前市場(chǎng)上的丹香冠心注射液均由上海中西制藥有限公司和上海新亞藥業(yè)高郵有限公司兩家企業(yè)生產(chǎn)。另有獲得批準(zhǔn)文號(hào)的四家生產(chǎn)企業(yè)未進(jìn)行生產(chǎn)。對(duì)上述兩個(gè)廠家產(chǎn)品各10批樣品進(jìn)行物質(zhì)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，同一廠家的10批產(chǎn)品得到的圖譜非常相似;兩個(gè)廠家的水溶性部分成分和強(qiáng)度基本相似，而揮發(fā)性成分差別較大。上海中西制藥有限公司的丹香冠心注射液總離子流圖中色譜峰個(gè)數(shù)較多，且峰強(qiáng)度較大，與降香揮發(fā)油對(duì)照品圖譜相比，多出包括三組同分異構(gòu)體共十余個(gè)峰，但無(wú)反式－苦橙油醇的峰。而上海新亞藥業(yè)高郵有限公司的丹香冠心注射液總離子流圖中峰個(gè)數(shù)較少，整體與降香揮發(fā)油對(duì)照品的圖譜相似，反式－苦橙油醇色譜峰較明顯，見圖1。推測(cè)兩家產(chǎn)品的差異可能是由降香原料和生產(chǎn)工藝中參數(shù)的不同造成。

5.5 本次物質(zhì)基礎(chǔ)研究表明，丹香冠心注射液中的揮發(fā)性成分主要由苦橙油醇及其衍生物組成，水溶性成分主要由丹參中的酚酸類成分組成，與根據(jù)工藝推測(cè)的結(jié)果一致。

5.6 色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具備分析速度快、高靈敏度、準(zhǔn)確質(zhì)量和全譜記錄等特點(diǎn)，可以提供準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)、碎片信息和可能結(jié)構(gòu)，對(duì)于未知化合物的鑒定是強(qiáng)有力的工具。本實(shí)驗(yàn)采用兩種色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)已有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物進(jìn)行了準(zhǔn)確的定性，并通過(guò)質(zhì)譜碎片信息的研究對(duì)丹香冠心注射液中同類組分或同系組分進(jìn)行大概的結(jié)構(gòu)推測(cè)，說(shuō)明是色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究物質(zhì)基礎(chǔ)的有力工具，也為物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供了一種思路。

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