孔祥鶴,牛銀波，武祥龍,翟遠(yuǎn)坤,潘亞磊,李晨睿,梅其炳，2

(1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院,陜西 西安 710072；2.第四軍醫(yī)大學(xué)藥理教研室,陜西 西安 710032)

隨著人口老齡化加劇，骨質(zhì)疏松癥(OP)作為老年人的骨代謝障礙性疾病，發(fā)病率高，易引發(fā)骨折，引起國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。人們積極尋找療效確切、副作用小、作用機(jī)理明確的抗OP藥物。根據(jù)成骨細(xì)胞在骨形成中的作用，通過判斷藥物是否能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨活性，是開發(fā)OP治療藥物的重要手段之一[1]。

中醫(yī)認(rèn)為黃芪具有補(bǔ)中益氣、升陽固表、托毒斂瘡等功效，中醫(yī)臨床常用含有黃芪的方劑、黃芪水煎液等防治骨質(zhì)疏松[2,3]。對黃芪的化學(xué)成分和藥理作用研究表明，黃芪黃酮、黃芪多糖為黃芪的主要活性成分，其中黃芪多糖能促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨活性[4]。劉心萍等[5]、陳華庭等[6]研究發(fā)現(xiàn)黃芪總黃酮能提高維甲酸致骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度，增強(qiáng)抗外力沖擊的能力，提示黃芪總黃酮可能是中藥黃芪抗骨丟失的有效部位之一。

作者通過觀察黃芪總黃酮(Astragalustotal flavonoids，ATF)對大鼠原代成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化能力的影響，進(jìn)一步尋找黃芪抗OP的有效部位；同時(shí)觀察其是否影響成骨細(xì)胞成骨活性相關(guān)的骨形成蛋白(BMP-2)、核心結(jié)合因子(Runx-2)的表達(dá)，以探討黃芪抗OP的作用機(jī)制，為深入研究中藥黃芪防治OP提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑及儀器

新生SPF級SD大鼠[合格證號：SCXK(軍) 2007-007]，1～3 d齡，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

黃芪總黃酮(80%)，西安恒堡生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；胎牛血清，四季青生物制劑公司；雌二醇(E2)、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、EDTA、二甲基亞砜、MTT、茜素紅、西吡氯銨，美國Sigma公司；ALP試劑盒，南京建成生物工程研究所；骨Ⅰ型膠原、骨鈣素ELISA試劑盒，上海藍(lán)基生物科技有限公司；BMP-2 ELISA試劑盒，美國R&D公司；Runx-2、Histone抗體，美國Bio world公司。

電子分析天平，美國Mettler Toledo公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；Model 680型酶標(biāo)儀、PAC300型電泳儀，美國Bio-Rad公司；CO2培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司；DU800型分光光度計(jì)，美國Beckman公司；培養(yǎng)板，丹麥Nunclon公司；高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為對照組(Control，10%血清培養(yǎng)液)、陽性對照雌激素組(E2，1×10-9mol·L-1雌激素)及各濃度的ATF組(用10%血清培養(yǎng)液配制)。

1.2.2 大鼠原代成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)

采用多次酶消化法從新生SD大鼠顱骨獲得原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)體系。

取4只出生1～2 d的SD大鼠，用75%乙醇溶液浸泡消毒5 min，取顱骨放入PBS緩沖溶液中，去除骨膜及周圍結(jié)締組織，見骨質(zhì)發(fā)白、透亮，將骨片浸沒于1∶4的胰蛋白酶/Ⅰ型膠原酶液中，剪成3 mm×3 mm大小，在5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃恒溫消化30 min。然后加入1 mg·mL-1的Ⅰ型膠原酶，將骨片剪成約1 mm×1 mm大小，于37 ℃恒溫消化40 min。離心，去消化液。用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中30 min后成纖維細(xì)胞先貼壁，輕輕吸取含成骨細(xì)胞的上清液于另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞傳至第2代時(shí)換用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。傳至第3代后，可使細(xì)胞得到純化，經(jīng)堿性磷酸酶(ALP)和茜素紅染色鑒定獲得較純的成骨細(xì)胞。

1.2.3 MTT法檢測成骨細(xì)胞增殖

取處于對數(shù)生長期的第3代成骨細(xì)胞，以每孔3×103個(gè)細(xì)胞的濃度接種于96 孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)12 h，分組加藥(0.001 μg·mL-1、0.01 μg·mL-1、0.1 μg·mL-1、1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、100 μg·mL-1)，空白對照孔只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞，用于調(diào)零。將96孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h及72 h，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀檢測570 nm處各孔吸光度(OD)。

1.2.4 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測成骨細(xì)胞分化

首先觀察不同濃度ATF對成骨細(xì)胞ALP活性的影響：取處于對數(shù)生長期的第3代成骨細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的濃度接種于24孔板中貼壁培養(yǎng)12 h，分組加藥(0.001 μg·mL-1、0.01 μg·mL-1、0.1 μg·mL-1、1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、100 μg·mL-1)，加藥6 d后，按照ALP試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用分光光度計(jì)測定各組520 nm處吸光度，計(jì)算ALP活性(U·mg-1)。

然后觀察不同時(shí)間點(diǎn)ATF對成骨細(xì)胞ALP活性的影響：實(shí)驗(yàn)步驟同上，選擇上述實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP活性的最適給藥濃度，分別觀察加藥2 d、4 d、6 d、8 d后，ATF對成骨細(xì)胞ALP活性的影響。

1.2.5 茜素紅染色檢測成骨細(xì)胞礦化

以每孔8×105個(gè)細(xì)胞的濃度接種于6孔板，貼壁培養(yǎng)12 h后更換含1 μg·mL-1ATF的培養(yǎng)液，并設(shè)對照組，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中每3 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)14 d后棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次，用95%乙醇固定1 h，蒸餾水清洗3次，加入40 mmol·L-1茜素紅(pH值4.2)染液，于37 ℃孵育15 min，再用蒸餾水清洗3次，在顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)并照相。然后加入100 mmol·L-1西吡氯銨溶液，室溫放置1 h，使與鈣結(jié)合的茜素紅充分溶解，用酶標(biāo)儀于570 nm處測定溶液吸光度，對礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行量化[7]。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定成骨細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原、骨鈣素及BMP-2蛋白的含量

1.2.7 Western blot法檢測成骨細(xì)胞Runx-2蛋白的表達(dá)

首先觀察不同時(shí)間點(diǎn)ATF對成骨細(xì)胞Runx-2表達(dá)的影響：取處于對數(shù)生長期的第3代成骨細(xì)胞，以每孔5×106個(gè)細(xì)胞的濃度接種于直徑為6 cm的無菌培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)12 h，ATF給藥濃度1 μg·mL-1，分別于0 h、12 h、24 h、48 h后用細(xì)胞刮刮下并收集細(xì)胞加入RI-PA細(xì)胞裂解液(含PMSF蛋白酶抑制劑)提取總蛋白，用酶標(biāo)儀進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，將膜浸泡在5%脫脂牛奶中4 ℃封閉過夜，依次加Runx-2、Histone抗體，一抗4 ℃孵育8 h，PBST洗膜后加二抗，室溫孵育1 h，用PBST及PBS洗膜后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，對條帶進(jìn)行灰度分析以觀察各蛋白表達(dá)水平的變化。

然后觀察不同濃度ATF對成骨細(xì)胞Runx-2表達(dá)的影響：分別加入濃度為0.1 μg·mL-1、1 μg·mL-1的ATF，并設(shè)對照組，48 h后收集細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)步驟同上。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件中的方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，Western blot條帶用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行灰度值定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 ATF對原代成骨細(xì)胞增殖的影響(圖1)

*表示P<0.05 vs Control，**表示P<0.01 vs Control，##表示P<0.01 vs ATF(10 μg·mL-1)

由圖1可看出，濃度為1 μg·mL-1、10 μg·mL-1的ATF作用于大鼠原代成骨細(xì)胞24 h能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.01)；0.1～10 μg·mL-1的ATF作用48 h后，細(xì)胞增殖率顯著增強(qiáng)(P<0.01)；0.01～10 μg·mL-1的ATF作用72 h后，能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05或P<0.01)。ATF濃度為10 μg·mL-1時(shí)促增殖作用最強(qiáng)，而ATF濃度為100 μg·mL-1時(shí)開始抑制細(xì)胞增殖，其48 h的促增殖作用強(qiáng)于24 h；E2組的作用強(qiáng)于對照組(P<0.01)，與ATF最適濃度(10 μg·mL-1)組相比，24 h及48 h無顯著性差異(P>0.05)，在72 h則比ATF組強(qiáng)(P<0.01)。

由于前置胎盤胎盤覆蓋于子宮前壁切口位置，傳統(tǒng)手術(shù)瘢痕可能會(huì)影響胎盤移動(dòng)，最終造成胎盤前置，加之子宮瘢痕內(nèi)膜過薄，使其絨毛組織侵入到子宮肌層中，使其胎盤植入幾率明顯提升。在進(jìn)行本次研究發(fā)現(xiàn)，全部患者均符合手術(shù)病理標(biāo)準(zhǔn)，患者經(jīng)過在腹彩超多普勒超聲的檢查發(fā)現(xiàn)，其診斷率為95.5%（85/89），漏診率4.9%（4/89）。對此，前置胎盤并發(fā)胎盤植入臨床診斷中，腹彩色超聲多普勒具有較高準(zhǔn)確率，且呈現(xiàn)無創(chuàng)安全的特點(diǎn)，具備臨床推廣與使用價(jià)值。

2.2 ATF對原代成骨細(xì)胞ALP活性的影響(圖2)

**表示P<0.01 vs Control，#表示P<0.05 vs ATF(1 μg·mL-1)

由圖2a可看出，加藥6 d后，ATF組濃度在0.01～1 μg·mL-1時(shí)能劑量依賴性地促進(jìn)成骨細(xì)胞的ALP活性(P<0.01)，1 μg·mL-1時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)；ATF濃度在10～100 μg·mL-1時(shí)，促進(jìn)作用下降。因此，選擇ATF最適濃度為1 μg·mL-1。觀察其在第2 d、4 d、6 d、8 d對成骨細(xì)胞的ALP活性的影響(圖2b)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從第4 d開始，ATF組及E2組開始促進(jìn)ALP活性(P<0.01)，第6 d達(dá)到最高，第8 d又開始下降；第6 d時(shí)E2組比ATF組強(qiáng)(P<0.05)。

2.3 ATF對原代成骨細(xì)胞礦化的影響(圖3)

**表示P<0.01 vs Control，#表示P<0.05 vs ATF(1 μg·mL-1)

由圖3可看出，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)14 d，各組在不同的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)了肉眼可見的白色結(jié)節(jié)，茜素紅染色后呈現(xiàn)大小、形態(tài)不一的紅色陽性結(jié)節(jié)；E2組及1 μg·mL-1ATF組與對照組相比均顯著增加了成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量(P<0.01)，E2組的作用較ATF組強(qiáng)(P<0.05)。

2.4 ATF對原代成骨細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原、骨鈣素的影響

在原代成骨細(xì)胞中加入1 μg·mL-1的ATF，用ELISA法檢測細(xì)胞上清中分泌Ⅰ型膠原及骨鈣素的表達(dá)，結(jié)果見圖4。

*表示P<0.05 vs Control，**表示P<0.01 vs Control，#表示P<0.05 vs ATF(1 μg·mL-1)

由圖4可看出，培養(yǎng)2 d后ATF對Ⅰ型膠原、骨鈣素蛋白表達(dá)無明顯影響；第4～8 d ATF則顯著促進(jìn)Ⅰ型膠原、骨鈣素蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)；第6～8 d時(shí)E2組的作用強(qiáng)于ATF組(P<0.05)。

2.5 ATF對原代成骨細(xì)胞BMP-2、Runx-2蛋白表達(dá)的影響

用ELISA法檢測細(xì)胞上清中分泌型BMP-2蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖5。

*表示P<0.05 vs Control，**表示P<0.01 vs Control

由圖5可看出，在0～24 h，BMP-2蛋白的表達(dá)逐漸升高，24 h達(dá)到最高，48 h時(shí)BMP-2蛋白的表達(dá)反而下降。表明，6～24 h，ATF能顯著促進(jìn)BMP-2蛋白表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。

用Western blot法檢測細(xì)胞中Runx-2蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖6。

*表示P<0.05 vs Control，**表示P<0.01 vs Control

由圖6可看出，在0～48 h，Runx-2蛋白的表達(dá)逐漸升高，在48 h 達(dá)到最高(圖6a)；0.1 μg·mL-1及1 μg·mL-1ATF能顯著促進(jìn)Runx-2蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴性變化(圖6b)。

2.6 討論

2.6.1 ATP對原代成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化影響的討論

(1)成骨細(xì)胞不僅決定骨形成，同時(shí)也調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的骨吸收，是骨代謝的重要功能細(xì)胞。成骨細(xì)胞的增殖與分化受到抑制，從而使骨質(zhì)量和骨量下降，骨小梁稀疏、斷裂，是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的病理機(jī)制之一。因此防治骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵是提高成骨細(xì)胞的增殖和分化水平。用MTT法檢測細(xì)胞增殖的原理是：增殖的活細(xì)胞通過線粒體能量代謝，將淡黃色的MTT還原成藍(lán)紫色的結(jié)晶(甲瓚)沉積在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍，形成的結(jié)晶與增殖的活細(xì)胞數(shù)成正比。本研究發(fā)現(xiàn)，ATF能顯著促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞增殖，濃度為10 μg·mL-1時(shí)促增殖作用最強(qiáng)，而ATF濃度為100 μg·mL-1時(shí)開始抑制細(xì)胞增殖。

(2)堿性磷酸酶ALP是參與骨代謝的重要蛋白質(zhì)，是識別和評價(jià)成骨細(xì)胞分化程度的早期指標(biāo)。Ⅰ型膠原蛋白及骨鈣素的合成及分泌是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，ATF濃度為0.01～1 μg·mL-1時(shí)，能劑量依賴性地促進(jìn)成骨細(xì)胞的ALP活性(P<0.01)，ATF濃度為1 μg·mL-1、給藥6 d時(shí)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，第6 d時(shí)陽性對照E2組比ATF組強(qiáng)(P<0.05)。同時(shí)，濃度為1 μg·mL-1的ATF給藥4～8 d能顯著促進(jìn)Ⅰ型膠原及骨鈣素的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。

(3)細(xì)胞進(jìn)入分化末期后，細(xì)胞局部聚集形成細(xì)胞團(tuán)，相互促進(jìn)成熟，胞體變小，隨著礦化基質(zhì)的增多而逐漸被埋入其內(nèi)，最終形成明顯的礦化結(jié)節(jié)。礦化結(jié)節(jié)的形成是成骨細(xì)胞體外成骨的重要標(biāo)志之一，是成骨功能的形態(tài)表現(xiàn)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，1 μg·mL-1ATF組顯著增加了成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量(P<0.01)。

ATF對成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化的促進(jìn)作用雖弱于陽性對照E2組，但是雌激素對子宮具有明顯的刺激作用[9]，而未見報(bào)道ATF有明顯的毒副作用。

2.6.2 ATF對原代成骨細(xì)胞BMP-2、Runx-2蛋白表達(dá)影響的討論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白系列(Bone morphogenetic proteins，BMPs)屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor，TGF-β)超家族，是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生長最重要的生長因子。其中以BMP-2活性最強(qiáng)，其對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有強(qiáng)烈的成骨誘導(dǎo)活性，而且能使誘導(dǎo)性骨細(xì)胞向確定性骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)骨形成[10]。核心結(jié)合因子αl(Core binding factorαl，Cbfαl，Runx-2)是近來發(fā)現(xiàn)的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細(xì)胞的分化成熟以及骨形成中起著關(guān)鍵性的作用[11]，可調(diào)節(jié)骨鈣素、Ⅰ型膠原、骨橋蛋白、骨涎蛋白等骨基質(zhì)蛋白的表達(dá)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，1 μg·mL-1ATF能顯著促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞BMP-2、Runx-2蛋白的表達(dá)，提示ATF促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞成骨活性的作用機(jī)理，可能是通過上調(diào)骨形成蛋白BMP-2的表達(dá)，以激活其下游細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Runx-2表達(dá)，最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化。

3 結(jié)論

黃芪總黃酮能促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞的增殖、分化與礦化，從細(xì)胞水平為黃芪總黃酮抗骨質(zhì)疏松提供有力依據(jù)。其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)BMP-2的表達(dá)，激活下游的轉(zhuǎn)錄因子Runx-2表達(dá)，以促進(jìn)細(xì)胞的成骨活性。天然產(chǎn)物的成分非常復(fù)雜，其作用不可能用一兩種機(jī)制就能解釋清楚，而骨質(zhì)疏松本身也是一種多因素、多環(huán)節(jié)的疾病，治療中需要標(biāo)本兼治、整體調(diào)節(jié)方能奏效，這也是中醫(yī)藥治療的特色。為確保中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化，使其更好地走向市場，走向國際，進(jìn)一步明確中藥的活性成分及藥理機(jī)制是十分必要的。

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