張小娜，唐 清，侯 敏，李 燁，徐曉玉

(西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶市藥效評價(jià)工程技術(shù)研究中心，重慶市銀花工程技術(shù)研究中心，西南大學(xué)中藥研究所，重慶 400716)

金銀花和山銀花均屬忍冬科植物，中醫(yī)臨床傳統(tǒng)使用歷史悠久，《中國藥典》2010年版將金銀花與山銀花分列，并將灰氈毛忍冬 L.macranthoides Hand.-Mazz作為山銀花的來源之一［1］。金銀花與山銀花的性味歸經(jīng):甘，寒，歸肺、心、胃經(jīng);功能與主治:清熱解毒，疏散風(fēng)熱，用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫?zé)岚l(fā)病。截至目前，關(guān)于灰氈毛忍冬的藥理作用尚未見系統(tǒng)地研究和報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將灰氈毛忍冬和忍冬(Lonicera japonica Thunb)的抗菌、抗炎及非特異性免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了比較研究，旨在豐富藥典新收錄藥材的基礎(chǔ)研究。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)藥物與主要試劑 灰氈毛忍冬(產(chǎn)自重慶秀山，購自重慶市秀山紅星中藥材開發(fā)有限公司，批號(hào):110718，經(jīng)西南大學(xué)齊紅藝教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物灰氈毛忍冬的干燥花蕾);忍冬(產(chǎn)自山東平邑，購自山東岐黃中藥飲片有限公司，批號(hào):110501，經(jīng)西南大學(xué)齊紅藝教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物忍冬的干燥花蕾);阿司匹林(太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):081101，規(guī)格:25 mg/片);角叉菜膠(生工生物工程上海有限公司，批號(hào):51303，規(guī)格:500 g/瓶);香菇菌多糖片(開封制藥有限公司，批號(hào):20090101，規(guī)格:10 mg/片);環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份公司，批號(hào):08120521，規(guī)格:0.2 g/瓶)等。

1.2 主要儀器 ELx800型酶標(biāo)儀，基因有限公司;EL-2046型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;UV3010紫外分光光度計(jì)，日立高新技術(shù)公司;光學(xué)顯微鏡，泰盟科技有限公司。

1.3 動(dòng)物 昆明種小鼠，♀、♂兼用，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g;SD大鼠，♂，SPF級(jí)，體重150～200 g。以上動(dòng)物均購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。昆明種小鼠質(zhì)量合格證號(hào):No 0003962，SD大鼠質(zhì)量合格證號(hào):No 0000022，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXD(渝)2007～2006。

1.4 樣品溶液制備 取灰氈毛忍冬和忍冬各適量，水提醇沉后濃縮成 0.25、0.5、1.0、2.0 g·ml－1儲(chǔ)備液，進(jìn)行抗炎和免疫調(diào)節(jié)預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明濃度為1.0 g·ml－1效果最好，最終確定此濃度為正式試驗(yàn)給藥濃度。

2 方法

2.1 抗菌實(shí)驗(yàn)［2－3］取灰氈毛忍冬和忍冬各適量煎煮，過濾，除菌，濃縮后，將其分別稀釋成1 000、500、250、125 、62.8、31.4、15.7、7.8 g·L－18 個(gè)濃度備用。

2.1.1 最小抑菌濃度(MIC)測定 在96孔板中加樣如下:試驗(yàn)孔1#－8#孔:培養(yǎng)基100 μl+菌液20 μl，再分別加入稀釋好的8個(gè)濃度的藥液120 μL;陰性對照孔9#孔:培養(yǎng)基220 μl+菌液 20 μl;陽性對照孔10#孔:培養(yǎng)基100 μl+2萬單位青霉素鈉溶液120 μl+ 菌液20 μl;培養(yǎng)基對照孔11#孔:培養(yǎng)基240 μl;空白對照孔:僅加對應(yīng)濃度的藥物和培養(yǎng)基。加完后密封，混勻后置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察各孔細(xì)菌生長情況，于630 nm下測各孔吸光度，依據(jù)吸光度計(jì)算MIC。

2.1.2 最小殺菌濃度(MBC)測定 根據(jù)MIC測定結(jié)果，分別吸取未見細(xì)菌生長的各管培養(yǎng)液50 μl，涂布于瓊脂平板中，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。平皿上菌落數(shù)小于5的最小稀釋度的藥物濃度即為MBC。

2.2 抗炎實(shí)驗(yàn)

2.2.1 對醋酸致毛細(xì)血管通透性增加的影響［4］昆明種小鼠50只，♂，隨機(jī)分為5組，ig給藥，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥0.5 h后尾iv質(zhì)量濃度為5 g·L－1伊文斯藍(lán)溶液0.01 ml·g－1，隨即 ip 體積分?jǐn)?shù)為0.006 的醋酸溶液0.01 ml·g－1，0.5 h 后處死，生理鹽水6 ml洗出腹腔內(nèi)伊文斯藍(lán)溶液4 ml，3 000 r·min－1離心10 min，590 nm處測定上清液吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出每只小鼠腹腔滲入染料量。

2.2.2 對角叉菜膠致大鼠足腫脹的抑制作用［5］SD大鼠40只，♂，隨機(jī)分為5組，ig給藥，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥前，在大鼠左后足踝處標(biāo)定測量基線，測量大鼠足趾體積2次，以平均值為基礎(chǔ)值。ig給藥0.5 h后，于左足趾皮下注射10 g·L－1角叉菜膠 0.1 ml/只，分別于致炎后 0.5、1、2、4、6 h測量足趾體積，計(jì)算各組腫脹值(各時(shí)間點(diǎn)足趾體積－基礎(chǔ)值)和抑制率。抑制率/%=(模型組足腫脹度－用藥組足腫脹度)/模型組足腫脹度×100%。

2.2.3 對棉球誘導(dǎo)大鼠肉芽組織增生的影響［6］SD大鼠36只，♂，隨機(jī)分為4組，ig給藥，每日1次，給藥7 d后，水合氯醛麻醉，在大鼠兩側(cè)肩胛處剪開約1 cm的小口，將棉球分別植入兩側(cè)肩胛處皮下，縫合創(chuàng)口。繼續(xù)ig給藥5 d后處死，取出棉球，去除結(jié)締組織，60℃烘箱放置12 h，稱重，減去原棉球重量，即為肉芽腫凈值，取兩側(cè)肉芽腫質(zhì)量的均值，計(jì)算抑制率。抑制率/%=(模型組肉芽腫重量－用藥組肉芽腫重量)/模型組肉芽腫重量 ×100%。

2.3 免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 對免疫低下小鼠免疫器官重量的影響［7］昆明種小鼠50只，♀、♂各半，隨機(jī)分為5組，ig給藥，每天1次，連續(xù)15 d，除空白組外，其余組d10每鼠ip環(huán)磷酰胺100 mg·kg－1，每天1次，連續(xù)3 d，d16取脾臟和胸腺，以脾重(mg)/體重(10 g)和胸腺重(mg)/體重(10 g)作為脾臟和胸腺指數(shù)。

2.3.2 對免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響［8］分組給藥方法同上，除正常組外，其余組d10每鼠ip環(huán)磷酰胺100 mg·kg－1，每天1次，連續(xù)3 d。末次給藥2 h后，每鼠尾iv印度墨汁0.01 ml·g－1。分別于2 min(T1)和10 min(T2)后從眼球取血 60 μl加到 6 ml 1 g·L－1Na2CO3溶液中，575 nm波長處測OD值。稱體重和肝脾重量，計(jì)算碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α。K=(lgA1－lgA2)/(T2－T1)，α =K1/3×體重/(肝重+脾重)。

3 結(jié)果

3.1 抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 MIC的測定結(jié)果 培養(yǎng)結(jié)束后肉眼可見，培養(yǎng)基對照孔、空白對照孔顏色、透明度均無變化;陰性對照孔液體渾濁，有白色沉淀產(chǎn)生;兩種藥材高濃度(1 000、500、250、125 g·L－1)孔也無外觀變化;低濃度孔(62.8、31.4、15.7、7.8 g·L－1)有變色現(xiàn)象，液體變渾濁。由Tab 1結(jié)果可以看出兩種藥材對6種常見致病菌均有不同程度的抑菌作用，灰氈毛忍冬對八疊球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用比忍冬強(qiáng)，對其他3種菌的抑菌作用均弱于忍冬。

3.1.2 MBC的測定結(jié)果 培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)基對照組無細(xì)菌生長;陰性對照組有大量菌落生長，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。兩種藥材對6種常見致病菌均有不同程度的殺菌作用(Tab 2)。結(jié)果顯示，灰氈毛忍冬對八疊球菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的殺菌效果均比忍冬強(qiáng)，對綠膿桿菌和傷寒桿菌與忍冬相當(dāng)，對大腸桿菌較忍冬弱。

3.2 抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與模型組相比灰氈毛忍冬1 g·kg－1和忍冬1 g·kg－1均能明顯抑制小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性(P＜0.01);降低大鼠足腫脹度(P＜0.05)和抑制大鼠肉芽組織增生(P＜0.01)，且二者比較差異無顯著性(P＞0.05)。結(jié)果見Tab 3、4、5。

3.3 免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 灰氈毛忍冬1 g·kg－1和忍冬1 g·kg－1均能明顯提高小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)(P＜0.01)。以上指標(biāo)灰氈毛忍冬和忍冬均差異無顯著性(P＞0.05)。結(jié)果見Tab 6。

4 討論

忍冬屬植物提取物中化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有綠原酸、黃酮類、皂苷類等，目前仍以綠原酸含量衡量其質(zhì)量優(yōu)劣，有文獻(xiàn)［9］研究表明灰氈毛忍冬中綠原酸含量為忍冬的2倍，體外抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，灰氈毛忍冬對革蘭氏陽性菌的殺菌能力強(qiáng)于忍冬，因此，綠原酸對革蘭氏陽性菌的殺菌能力是否呈劑量依賴關(guān)系值得研究;同時(shí)，忍冬對大腸桿菌的殺菌能力強(qiáng)于灰氈毛忍冬，對綠膿桿菌、金葡菌、傷寒桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌能力也強(qiáng)于后者，說明了該類藥材的抗菌效果并不完全依賴于綠原酸含量，可能有其他成分起協(xié)同作用;體內(nèi)抗炎、免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)結(jié)果差異無顯著性，可能與灌胃給藥方式下綠原酸生物利用度低有關(guān)［10］，但也可能是由提取物中其他有效成分所致?？傊?，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了灰氈毛忍和忍冬在上述藥理活性上強(qiáng)度相當(dāng)，為該藥材的廣泛應(yīng)用提供了理論依據(jù)，而在抗病毒、抗氧化、保肝利膽等方面二者是否存在相同或不同的藥效有待進(jìn)一步研究。

Tab 1 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on MIC in six kinds of pathogenic bacteria(g·L－1)

Tab 2 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on MBC in six kinds of pathogenic bacteria(g·L－1)

Tab 3Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on abdominal capillary permeability in mice(±s，n=10)

Tab 3Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on abdominal capillary permeability in mice(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs normal;##P＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg－1 Inhibitory ratio/%Normal – 0.08 ±0.07 0.04 Abdominal capillary permeability A Azovan blue/mg·L－1–Model – 0.77 ±0.28＊＊ 1.04 0 APC 0.2 0.20 ±0.16## 0.22 78.85 L.macranthoides Hand-Mazz 1 0.37 ±0.07## 0.46 55.77 Lonicera japonica Thunb 1 0.44 ±0.13##0.57 45.19

Tab 4 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on carrageenan-paw edema in rats(±s，n=8)

Tab 4 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on carrageenan-paw edema in rats(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg－1 Content after paw edema/ml Inhibitory ratio after paw edema/%Before edema/ml 0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h Normal － 1.06 ±0.07 0.000.43 0.02 ±0.03 0.03 ±0 0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h.04 0.04 ±0.05 0.03 ±0.04 － － － － －Model - 1.11 ±0.12 0.15 ±0.07＊＊ 0.21 ±0.07＊＊ 0.29 ±0.14＊＊ 0.33 ±0.14＊＊ 0.41 ±0.16＊＊ 0 0 0 0 0 APC 0.2 1.04 ±0.06 0.13 ±0.04 0.17 ±0.08 0.17 ±0.10# 0.24 ±0.11 0.24 ±0.09## 13.33 19.05 41.38 27.27 41.6 L.macranthoides Hand.-Mazz 1 1.12 ±0.07 0.10 ±0.04＊＊ 0.12 ±0.06## 0.15 ±0.09## 0.22 ±0.10# 0.23 ±0.12## 33.33 42.86 42.28 33.3 43.0 Lonicera japoni ca Thunb 1 1.11 ±0.07 0.09 ±0.02## 0.11 ±0.04## 0.21 ±0.15 0.31 ±0.15 0.30 ±0.17 40.0 47.62 27.59 0.03 26.3

Tab 5 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on cotton pellet-induced granuloma in rats(±s，n=9)

Tab 5 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on cotton pellet-induced granuloma in rats(±s，n=9)

＊＊P＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg－1 Model - 40.5 ±5.1 0 APC 0.2 17.5 ±4.3＊＊ 56.8 L.macranthoides Hand.-Mazz 1 25.2 ±7.4＊＊ 37.8 Lonicera japonica Thunb 1 29.5 ±7.3＊＊Increased weight of granuloma/mg Inhibitory ratio/%27.2

Tab 6 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on index of immune organ and phagocytosis of macrophages in mice(±s，n=10)

Tab 6 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on index of immune organ and phagocytosis of macrophages in mice(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg－1 Index of immune organ Index of thymus/mg·(10 g)－1 Index of spleen/mg·(10 g)－1 Phagocytosis of macrophages K/×10－2α Normal － 13.77 ±2.16 25.91 ±3.91 2.75 ±0.79 6.28 ±0.99 Model - 6.13 ±0.61＊＊ 14.14 ±1.90＊＊ 0.55 ±0.30＊＊ 3.21 ±0.70＊＊LNT 0.0045 9.71 ±1.30## 21.41 ±1.69## 1.70 ±0.70## 5.24 ±1.00##L.macranthoides Hand.-Mazz 1 9.18 ±1.16## 20.08 ±2.34## 1.80 ±0.65## 5.21 ±1.03##Lonicera japonica Thunb 1 8.43 ±1.29## 19.63 ±2.42## 1.56 ±0.74## 4.74 ±1.00##

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