王德國，王 新，劉 玉，王 星，邢 文，李祥東，楊 勝，王安才，孫賢林

(1.皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院老年心血管科，安徽蕪湖 241001;2.安徽省立醫(yī)院心臟科，安徽合肥 230001)

心肌細胞間縫隙連接(gap junction，GJ)是電沖動的快速傳導通路，主要分布在心肌細胞端－端連接處。當心肌缺血時，Cx43表達降低、向心肌細胞側(cè)邊分布，嚴重影響電傳導，是心律失常發(fā)生的主要機制之一［1］。最近，Shaw 等［2］發(fā)現(xiàn)微管系統(tǒng)是細胞Cx43快速運輸并裝配到閏盤部位的結構基礎，在心肌缺血或者氧化應激時，導致Cx43在細胞側(cè)邊分布和無序分布，細胞間電傳導相應減慢［3］。Taxol作為一種微管穩(wěn)定劑，可促進缺氧狀態(tài)下微管的聚合［4－5］。本實驗旨在觀察微管穩(wěn)定劑Taxol是否參與心肌缺血損傷的導致的Cx43重構，探討穩(wěn)定劑Taxol能否作為新的抗心律失常藥物。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 AnaeroPack安寧包厭氧培養(yǎng)袋中(日本三菱公司)，Langendorff灌注裝置(南京美易科技有限公司)，電泳槽及電泳儀(美國BIORAD公司)，共聚焦顯微鏡(德國Zeiss);Taxol購自于Sigma公司，兔抗鼠Cx43抗體(Abcam公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 將分離的大鼠心肌細胞隨機分為8組，以臺盼藍染色法測定細胞存活率。(1)對照組:細胞靜置120 min;(2)缺氧組:心肌細胞低氧120 min;(3)Taxol干預組:在缺氧前給予不同濃度的 Taxol(0.1、1 、10、100、1、10 nmol·L－1)，其余同缺氧組。

1.2.2 用酶解法分離大鼠心室肌細胞［6］大鼠斷頸處死后取出心臟，4℃氧飽和Tyrode液洗凈血液，Langendorff恒流灌流(37℃)，流速10 ml·min－1，并以純O2飽和。無鈣Tyrode液灌流5 min后再以I型膠原酶0.3 g·L－1的無鈣 Tyrode液灌流消化10 min。隨之將心室肌剪碎，于含0.1%BSA的無鈣Tyrode液中37℃孵育15 min，細胞懸液用200 μm的尼龍網(wǎng)過濾，濾液在無鈣Tyrode液中逐步復鈣至Ca2+濃度為1.25 mmol·L－1。無鈣 Tyrode液成分(mmol·L－1):NaCl 100.0，KCl 10.0，KH2PO41.2，MgSO45.0，葡萄糖20.0，牛磺酸10.0，MOPS 10.0(pH 7.4)。

Tab 1Effects of microtubule stabilizer(Taxol)on cell viability exposed to hypoxic condition(±s，n=8)

Tab 1Effects of microtubule stabilizer(Taxol)on cell viability exposed to hypoxic condition(±s，n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group;#P＜0.05 and##P ＜0.01 vs hypoxic group(0 nmol·L－1Taxol)

－1 0.1 1 10 100 1000 10000 Rod cells numbers 123±23 35±11＊＊ 45±14＊＊ 66±21＊＊## 84±26＊＊## 53±22＊＊# 42±12＊＊ 37±11 Control Taxol/nmol·L 0＊＊Cell viability(%)78±12 23±11＊＊ 34±12＊＊ 42±12＊＊## 53±13＊＊## 38±9＊＊## 35±10＊＊# 28±11＊＊

1.2.3 心肌細胞低氧模型 取分離的心肌細胞懸液1 ml，加入到16孔培養(yǎng)板中，按實驗設計將缺氧及干預組細胞放到AnaeroPack安寧包厭氧培養(yǎng)袋中，其中的氧清除劑能迅速將O2通過轉(zhuǎn)換為CO2，從而使氧濃度降低到1%以下，氧指示劑由藍色變?yōu)闊o色［7］。厭氧靜置120 min作為缺氧模型。缺氧120 min后，在倒置顯微鏡下觀察每個高倍視野下的桿狀心肌細胞數(shù)目。

1.2.4 心肌細胞存活率的測定 吸取各組心肌細胞懸液到96孔培養(yǎng)板，以0.4%臺盼藍排斥反應來判斷心肌細胞存活率，死亡的細胞呈藍色，存活的細胞則不著色，在顯微鏡下每個樣品記數(shù)400個心肌細胞，計算細胞存活率。同時在顯微鏡下觀察每個高倍視野下的桿狀心肌細胞數(shù)目［6］。

1.2.5 免疫熒光染色檢測單個心肌細胞Cx43分布［7］吸取少量心肌細胞滴到載玻片上，加入4%多聚甲醛固定5 min，熱風吹干，PBS液輕洗細胞3次，滴加10%山羊血清封閉非特異性抗原(30 min)，滴加1∶200抗Cx43單克隆抗體，4℃過夜，PBS洗后滴加TRTC標記的抗兔抗鼠二抗，37℃ 30 min，DAPI染核5 min，PBS洗后封片，激光共聚焦顯微鏡觀察切片。

1.2.6 Western blot檢測心肌細胞 Cx43蛋白表達［7］將各組心肌細胞離心、裂解、離心以提取總蛋白質(zhì)。采用12%分離膠及5%濃縮膠進行SDSPAGE電泳。PVDF膜和凝膠在冰浴條件下60 mA恒流電轉(zhuǎn)1 h。將PVDF膜在1%BSA 4℃封閉過夜。加入一抗工作液(1∶1 000)，37℃孵育1 h。加入HRP標記的二抗工作液(1∶2 000)，37℃孵育1 h。加入TCL發(fā)光液顯色、曝光、掃描保存。Image J圖像分析軟件定量分析Cx43表達。

2 結果

2.1 微管穩(wěn)定劑對缺氧心肌細胞存活的影響 缺氧時心肌細胞明顯受損，細胞存活率明顯降低，鏡下計數(shù)示桿狀心肌細胞數(shù)目明顯減少(P＜0.01)。Taxol在0.1～10 nmol·L－1濃度下成劑量依賴性地提高桿狀細胞數(shù)，提高心肌細胞存活率，而100 nmol·L－1～10 μmol·L－1濃度下桿狀細胞數(shù)開始減少，細胞存活率明顯降低(P＜0.01)。

2.2 微管穩(wěn)定劑對缺氧心肌細胞Cx43蛋白表達的影響 如Fig 1所示，缺氧條件下，心肌細胞Cx43蛋白表達下降，0.1～10 nmol·L－1濃度范圍內(nèi)的Taxol呈劑量依賴性地改善心肌細胞的Cx43表達，但 100 nmol·L－1～ 10 μmol·L－1的濃度范圍內(nèi)的Taxol則抑制心肌Cx43。

Fig 1 Effects of microtubule stabilizer(Taxol)on Cx43 expression of cardiac myocytes exposed to hypoxic condition.(±s，n=8)

2.3 微管穩(wěn)定劑對缺血心肌細胞Cx43分布的影響 如Fig 2所示，非缺氧組心室肌細胞Cx43(紅色)主要分布在心肌細胞的兩端的閏盤處(A)，當心肌細胞缺氧120 min，細胞側(cè)邊出現(xiàn)Cx43分布(B)。0.1～10 nmol·L－1濃度范圍內(nèi)的Taxol呈劑量依賴性地抑制側(cè)邊 Cx43(C、D、E)，100 nmol·L～1－10 μmol·L－1的濃度范圍內(nèi)(F、G、H)，心肌細胞兩端Cx43也明顯受到抑制。

3 討論

缺血導致心肌細胞骨架結構及功能障礙，微管是細胞骨架的重要組成部分，影響心肌細胞蛋白的轉(zhuǎn)運和功能。Taxol作為一種微管穩(wěn)定劑，主要位點是微管蛋白/微管系統(tǒng)，它能促進微管聚合，抑制微管解聚［8－9］。本研究以離體心肌細胞缺氧模型，觀察電傳導重要離子通道Cx43在缺氧下的表達與分布情況，并以不同劑量的微管穩(wěn)定劑干預，觀察其細胞毒性及對Cx43的穩(wěn)定作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的Taxol可明顯減輕缺氧所致的心肌細胞死亡，維持細胞的桿狀結構。有研究顯示Taxol可明顯維持缺氧條件下的心肌Ca2+-ATPase活性，并減輕心肌細胞內(nèi)的鈣離子濃度［10］。對鈣穩(wěn)態(tài)的保護作用可能是Taxol降低細胞死亡的原因之一。然而，本研究也發(fā)現(xiàn)大劑量的Taxol明顯增加缺氧心肌細胞的壞死和攣縮。但具體毒性機制不甚清楚，可能與大劑量的Taxol抑制了心肌細胞的能量代謝及信號蛋白的轉(zhuǎn)運有關。

Cx43組成的心肌細胞間縫隙連接是快速電傳遞通道，在心律失常產(chǎn)生機制中具有重要作用。心肌缺血時，心肌細胞的Cx43分布紊亂，表達量降低，心肌閏盤連接處的Cx43分布減少，而細胞質(zhì)及心肌細胞的側(cè)邊(非閏盤區(qū)域)Cx43分布增加。最終導致心肌細胞見電傳導延緩，從而參與折返性心律失常的發(fā)病機制［7］。迄今為止Cx43重新分布的原因并不完全清楚。最近研究顯示微管正端結合蛋白(EB1)促進微管穩(wěn)定，引導Cx43定向轉(zhuǎn)運到細胞膜，并組裝成縫隙連接，從而形成心肌細胞間的快速電連接［2］。心肌應激狀態(tài)下，Cx43不能定向運輸?shù)郊毎B接處形成縫隙連接，去除應激或使用抗氧化應激均可降低Cx43和EB1向胞質(zhì)內(nèi)分布。同樣，EB1表達抑制同樣造成Cx43不能正確的定向裝配。適時熒光共聚焦顯微鏡可清楚觀察到EB1向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運與Cx43側(cè)化、微管紊亂同步改變［3］。

本研究顯示低劑量Taxol呈劑量依賴性地減輕心肌細胞缺氧所致的Cx43表達抑制，形態(tài)學觀察可見Taxol可明顯抑制缺氧所致的Cx43側(cè)邊分布。這提示微管穩(wěn)定性參與缺氧條件下Cx43的重新分布，對缺血性心律失常具有潛在影響［10］。由于縫隙連接重構在缺血性心臟病心律失常機制中扮演很關鍵角色，因此低劑量的Taxol有可能具有抗心律失常作用。另外，本研究也觀察到大劑量的Taxol則明顯抑制心肌Cx43表達，并進一步抑制細胞閏盤處的Cx43分布，其機制可能是抑制了Cx43的蛋白合成。

Fig 2 Effects of microtubule stabilizer(Taxol)on Cx43 distribution of cardiac myocytes exposed to hypoxic

綜上所述，低劑量Taxol可減輕缺氧所致的心肌細胞損傷，維持細胞的桿狀結構，同時穩(wěn)定Cx43在心肌閏盤處的分布，具有潛在的抗心律失常作用。但大劑量Taxol具有明顯的細胞毒性，在進行整體實驗中需要控制用量和速度。

［1］ Wang Y，Hill J A.Electrophysiological remodeling in heart failure［J］.J Mol Cell Cardiol，2010，48(4):619 －32.

［2］ Shaw R M，F(xiàn)ay A J，Puthenveedu M A，et al.Microtubule plusend-tracking proteins target gap junctions directly from the cell interior to adherens junctions［J］.Cell，2007，128(3):547 － 60.

［3］ Smyth J W，Hong T T，Gao D，et al.Limited forward trafficking of connexin 43 reduces cell-cell coupling in stressed human and mouse myocardium［J］.J Clin Invest，2010，120(1):266 －79.

［4］ Lampidis T J，Kolonias D，Savaraj N，et al.Cardiostimulatory and antiarrhythmic activity of tubulin-binding agents［J］.Proc Natl Acad Sci U S A 1992，89(4):1256－60.

［5］ Parker K K，Taylor L K，Atkinson J B，et al.The effects of tubulin－binding agents on stretch-induced ventricular arrhythmias［J］.Eur J Pharmacol，2001，417(1－2):131－40.

［6］ 石曉路，柳 絮，郭會彩，等.大鼠心肌細胞分離方法的改進［J］.中國藥理學通報，2010，26(5):687－90.

［6］ Shi X L，Liu X，Guo H C，et al.An improvedmethod of isolation of rat cardiac myocytes［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(5):687－90.

［7］ Wang D，Shen W，Zhang F，et al.Connexin43 promotes survival of mesenchymal stem cells in ischaemic heart［J］.Cell Biol Int，2010，34(4):415－23.

［8］ Orr G A，Verdier-Pinard P，McDaid H，et al:Mechanisms of Taxol resistance related to microtubules［J］.Oncogene，2003，22(47):7280－95.

［9］ Manfredi J J，Parness J，Horwitz S B.Taxol binds to cellular microtubules［J］.J Cell Biol，1982，94(3):688 －96.

［10］ Xiao J，Cao H，Liang D，et al.Taxol，a microtubule stabilizer，prevents ischemic ventricular arrhythmias in rats［J］.J Cell Mol Med，2011，15(5):1166 －76.