王萍兒，盧德趙，林韜琦，楊 貞，沃興德

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310053)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是常見的嚴重危害人類健康的動脈慢性炎癥性疾病。主要的病因為膽固醇在外周血管中大量積聚，出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂，引起內(nèi)膜灶性纖維性增厚及粥樣斑塊形成，繼而引發(fā)動脈粥樣硬化［1－2］。肝臟是膽固醇代謝的最主要器官，如何促進肝臟清除體內(nèi)過多的膽固醇，減少膽固醇在血管內(nèi)壁的沉積是預(yù)防和治療AS的關(guān)鍵［3］。

絞股藍(gynostemma pentaphyllum，GP)為葫蘆科絞股藍屬植物絞股藍的根狀莖或全草，味甘苦、性寒，有清熱解毒、化痰止咳、益氣健脾之功效［4］。絞股藍總皂苷(gypenosides，GPS)是絞股藍最主要的生物活性成分之一，能夠有效地保護心腦血管和肝臟、降低血脂和膽固醇、消除自由基，促進肝細胞LDL-R 的表達［5］，具有良好的抗 AS 作用［6－7］。本研究擬以HepG2細胞為研究對象，探討在高脂環(huán)境中絞股藍總皂苷對膽固醇逆運轉(zhuǎn)過程中起重要作用的清道夫受體SR-B1表達的影響，為絞股藍總皂苷抗AS作用機制的研究和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HepG2細胞株從中國科學(xué)院上海細胞庫購買;培養(yǎng)液RPMI 1640、胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料研究所;絞股藍總皂苷(產(chǎn)品批號:20101026)購于安徽蕪湖甙爾塔研究所;總膽固醇和游離膽固醇試劑盒從寧波塞克生物技術(shù)有限公司購買;細胞膜蛋白抽提試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所;β-actin、SR-BⅠ羊抗兔抗體均購于Santa Cruz公司;eECL Western blot Kit試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司;SR-BⅠmRNA引物合成自上海生工生物工程有限公司;PCR、逆轉(zhuǎn)錄試劑試劑均購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司，SsoFast EvaGreen Supermix試劑購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗儀器 P80MX超速離心機購自日本Hitachi公司，SpectraMax M3酶標儀購自美國MD公司，AKTA液相色譜儀購自美國GE公司，細胞培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司，DM IL型倒置熒光顯微鏡購自德國 Leica公司，IQ5熒光定量 PCR儀、SDSPAGE電泳儀、WB轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 HDL-CE的提取 取健康人血清經(jīng)序列超速離心法分離密度1.063-1.125 kg·L－1的 HDL-CE粗提物，經(jīng)Sepharose 6B凝膠層析法分離純化HDLCE。將純化的HDL-CE轉(zhuǎn)入截留小分子的透析袋中，用PBS緩沖液透析24 h，PEG20000濃縮后用Lowery法測定蛋白濃度，4℃保存。

1.4 細胞培養(yǎng)及細胞增殖活力的檢測 HepG2細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，當細胞匯合度達80%～90%時進行傳代培養(yǎng)或進行后續(xù)試驗。將細胞以1.0×104個/孔密度傳代培養(yǎng)于96孔板中，貼壁培養(yǎng)8 h，加入不同劑量的絞股藍總皂苷，使其終濃度為30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、400 mg·L－1，每個濃度設(shè)6個重復(fù)，同時加入HDL-CE(終濃度為300 mg·L－1)進行共孵育培養(yǎng)，每孔終體積為200 μl。作用24 h后每孔中加入20 μl 5 g·L－1MTT暗室孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO/孔，震蕩混勻沉積在孔底的藍紫色結(jié)晶甲臜，并在10 min內(nèi)于570 nm波長處檢測各孔吸光度值(OD570)，確定絞股藍總皂苷對高脂環(huán)境下的HepG2細胞增殖的影響。

1.5 油紅O染色 將細胞以4.0×106個/孔密度傳代培養(yǎng)于6孔板中，貼壁培養(yǎng)8 h。隨機分為對照組(正常培養(yǎng) HepG2細胞)、模型組(300 mg·L－1HDL-CE處理HepG2細胞24 h)、洛伐他汀組(300 mg·L－1HDL-CE、20 μmol·L－1洛伐他汀與 HepG2細胞共孵育24 h)、GPS處理組(300 mg·L－1HDLCE、不同濃度絞股藍總苷皂苷與HepG2細胞共孵育24 h)。用PBS緩沖液清洗3次，加入10%甲醛磷酸緩沖液固定20 min，PBS輕輕洗3次，用油紅O染色30 min，再用60%的異丙醇固定5 min，立即用PBS清洗3次，顯微鏡下觀察荷脂細胞形態(tài)及脂滴分布情況。

1.6 細胞內(nèi)總膽固醇和膽固醇酯的測定 將細胞以1.0×107個/孔密度傳代培養(yǎng)于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，貼壁培養(yǎng)8 h，實驗分組“同1.5”，各組細胞用預(yù)冷PBS清洗5次，細胞刮刀輕柔刮下細胞，分別轉(zhuǎn)移至1.5 ml的EP管中，用無水乙醇超聲破碎萃取細胞內(nèi)膽固醇，參照總膽固醇(TC)和游離膽固醇(FC)檢測試劑盒操作說明書，測定細胞內(nèi)TC和FC的含量，計算細胞內(nèi)膽固醇酯(CE)的含量，并根據(jù)CE=TC-FC，求出荷脂細胞內(nèi)CE的含量。

1.7 Real-time PCR檢測SR-BⅠ的mRNA表達按TRIzol試劑盒說明書一步法提取各處理組細胞(實驗分組同“1.5”)總RNA，用核酸蛋白分析儀測RNA在260 nm和280 nm的吸光度(A)值，使A260/A280的比值介于1.8～2.2之間。并根據(jù)260 nm的A值對樣品的總RNA進行初步定量，并用Invitrogen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA，再通過引物進行熒光定量PCR擴增。包括β-actin引物:上游5'-CTGACCCTGAAGTACCCCATT-3'，下 游:5'-TCTGCGCAAGTTAGGTTTTGT-3'，擴增產(chǎn)物長度為324 bp;SR-BⅠ引物:上游5'-GGCGGTGATGATGGAGAAT-3'，下游 5'-TGAAGAGCCCAGAGTCGGA-3'，PCR 擴增產(chǎn)物長度為 227 bp。采用 Bio-Rad SsoFast EvaGreen Supermix熒光預(yù)混液于Bio-Rad iQTM5多重實時熒光定量PCR儀系統(tǒng)來檢測上述引物產(chǎn)品的mRNA表達量，實驗結(jié)果以β-actin的mRNA進行標準化。

1.8 Western blot檢測SR-BⅠ的蛋白質(zhì)表達 各實驗組細胞用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗5次，收集細胞后按照細胞膜蛋白抽提試劑盒提取各實驗組膜蛋白，并用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。一定量的膜蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混合后煮沸5 min，SDS-PAGE電泳80 V恒壓2 h，WB濕轉(zhuǎn)(0.45 μm的PVDF膜)200 mA恒流2 h，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST漂洗3次后分別加入一抗SR-BⅠ(1∶200稀釋)和β-actin(1∶600稀釋)4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，于37℃二抗(1∶1 000)反應(yīng)2 h后進行ECL顯色。用美國Bio-Rad公司的凝膠成像分析系統(tǒng)分析WB電泳條帶，以β-actin作為內(nèi)參，計算各處理組目的蛋白SR-B1的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 絞股藍總皂苷對HepG2源性荷脂細胞增殖活力的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，與對照組相比較，0～120 mg·L－1絞股藍總皂苷對HepG2源性荷脂細胞增殖無影響，大于120 mg·L－1時出現(xiàn)對細胞增殖的抑制作用(Fig 1)。

Fig 1 Effects of gypenosides on proliferation of HepG2-derived cholesterol-road cell

Fig 2 Oil red O staining maps of HepG2 cell(10×40)

2.2 細胞形態(tài)觀察及油紅O染色 倒置顯微鏡觀察對照組HepG2貼壁細胞呈不規(guī)則形，胞質(zhì)凸出飽滿，輪廓清晰。模型組細胞、洛伐他汀組細胞、GPS處理組細胞邊緣不光滑，胞質(zhì)不凸出，細胞折光度下降。油紅O染色觀察胞內(nèi)脂滴分布情況(Fig 2)，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，各組胞內(nèi)脂滴明顯增多，染色后細胞邊緣呈紅色“手環(huán)狀”，細胞中央出現(xiàn)紅色小顆粒，且鏡下觀察顯示模型組、洛伐他汀組、GPS處理組細胞內(nèi)脂滴含量差異無顯著性。

2.3 絞股藍總皂苷對HepG2胞HDL-CE脂質(zhì)攝取的影響 實驗結(jié)果顯示(Fig 3)，與對照組相比較，模型組(P＜0.05)、洛伐他汀組(P ＜0.01)、GPS處理組(P＜0.01)細胞內(nèi)TC含量明顯增加;與模型組相比較，洛伐他汀組和GPS處理組細胞內(nèi)TC含量差異均無顯著(P＞0.05);且所有實驗組間細胞內(nèi)FC含量無差異(P＞0.05)。說明300 mg·L－1HDL-CE孵育細胞24 h可能是通過增加細胞內(nèi)CE的含量來提高胞內(nèi)TC的水平，使細胞處于一種高脂狀態(tài)，20 μmol·L－1洛伐他汀和不同濃度 GPS 作用于高脂環(huán)境中的HepG2細胞后胞內(nèi)脂質(zhì)含量仍處于較高水平。

2.4 絞股藍總皂苷對HepG2細胞SR-BⅠmRNA表達的影響 與對照組SR-BⅠ mRNA水平比較，模型組SR-BⅠ mRNA水平明顯增加，而洛伐他汀組SR-BⅠmRNA的表達卻降低了，60和240 mg·L－1GPS處理組SR-BⅠ mRNA的表達差異無顯著性，120 mg·L－1GPS處理組SR-BⅠ mRNA的表達增加。與模型組比較，除120 mg·L－1GPS處理組SR-BⅠmRNA表達下降不明顯外，洛伐他汀組和其余GPS處理組細胞的SR-BⅠ mRNA表達均明顯下降(Fig 4)。

Fig 3 Effects of gypenosides on content of intracellular TC

2.5 絞股藍總皂苷對HepG2細胞SR-BⅠ蛋白表達的影響 應(yīng)用免疫印跡法對各組細胞SR-BⅠ蛋白表達進行檢測。實驗結(jié)果顯示β-actin蛋白條帶均一(Fig 5)，可用于實驗數(shù)據(jù)分析。與對照組比較，模型組SR-BⅠ蛋白表達明顯增加，說明HDL-CE可以上調(diào)HepG2細胞SR-BⅠ蛋白的表達，60 mg·L－1GPS處理組SR-BⅠ蛋白的表達水平無差異，120、240 mg·L－1GPS處理組SR-BⅠ蛋白的表達水平均降低;而與模型組相比較，GPS各處理組SR-BⅠ蛋白的表達水平均降低，說明GPS可以劑量依賴性下調(diào)高脂環(huán)境中HepG2細胞SR-BⅠ蛋白的表達。

Fig 4 Effects of GPS on SR-BⅠmRNA expression in HepG2 cell

Fig 5 Effects of GPS on SR-BⅠprotein expression in HepG2 cell

3 討論

研究已證明絞股藍總皂苷具有良好的調(diào)脂和抗動脈粥樣硬化作用，但是對其作用機制研究的尚不深入。血漿高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)具有抗氧化、抗炎、抑血栓形成、促內(nèi)皮修復(fù)等作用，還能介導(dǎo)“膽固醇逆向轉(zhuǎn)運”(RCT)來降低血管脂質(zhì)的沉積，與AS的發(fā)生發(fā)展呈負相關(guān)性［8］。血清中的貧脂HDL可以結(jié)合外周組織中多余的膽固醇(包括AS斑塊)，形成新生的圓盤狀HDL，并在卵磷脂膽固醇酯?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的作用下將膽固醇酯化［9］，由球狀小顆粒的HDL3逐步轉(zhuǎn)變成大顆粒的HDL2(成熟的HDL-C，即HDL-CE)，再轉(zhuǎn)運到肝臟進行再循環(huán)或形成膽汁酸代謝，或轉(zhuǎn)運到類固醇激素生成組織被分泌，實現(xiàn)膽固醇的流出、酯化及清除，以上途徑均需清道夫受體 SR-B1的參與［10］。

B型Ⅰ類清道夫受體(SR-BⅠ)是迄今為止介導(dǎo)肝臟選擇性攝取 HDL-CE的主要受體［11］，將HDL-CE轉(zhuǎn)運到肝臟定位的細胞膜區(qū)域并在此通過細胞特殊的膽固醇中間水解酶把HDL-CE水解成游離膽固醇，從膽汁酸中清除或合成極低密度脂蛋白(VLDL)進行代謝，從而促進RCT的進行，清除外周組織中過多沉積的膽固醇，保護血管，防止AS的形成或改善已形成的AS。此外，HDL上的載脂蛋白與脂質(zhì)脫離后可以回到外周中進行再循環(huán)。

莫中成等［12］研究表明高密度脂蛋白可以上調(diào)HepG2細胞中SR-BI的表達，增加細胞內(nèi)膽固醇的蓄積，促進肝細胞攝脂功能。Jeyakumar等［13］發(fā)現(xiàn)WNIN/Ob品系肥胖鼠體內(nèi)血清HDL-C水平異常升高，肝臟SR-BI受體表達下調(diào);而補給Vit A后可以上調(diào)肝臟SR-BI受體的表達，促進RCT，從而來實現(xiàn)WNIN/Ob品系肥胖鼠HDL-C的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。Fluiter等［14］研究顯示高脂飲食和17α-乙炔基雌二醇(EE)能下調(diào)大鼠的肝實質(zhì)細胞中SR-BI蛋白表達，而且伴隨著肝實質(zhì)細胞對HDL-CE中脂質(zhì)攝取能力的下降。Witt等［15］針對 Vit E對大鼠肝組織和HepG2細胞SR-BⅠ蛋白和基因表達的影響進行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)Vit E能降低HepG2細胞的SRBⅠ蛋白表達水平，同時還伴隨PKC蛋白表達的下調(diào)，因此推測Vit E可能是通過抑制PKC信號通路調(diào)節(jié)細胞SR-BⅠ受體的表達。

本實驗結(jié)果顯示，300 mg·L－1HDL-CE孵育細胞24 h后胞內(nèi)總膽固醇和膽固醇酯的含量明顯增加，細胞膜受體SR-BⅠ的mRNA和蛋白表達水平明顯增加，說明HDL-CE可能是通過增強HepG2細胞膜表面受體SR-BⅠ的表達來促進細胞對HDL-CE中膽固醇酯的攝取，清除對外周中過多的脂質(zhì)，達到抗動脈粥樣硬化的作用。但不同濃度絞股藍總皂苷與HDL-CE與細胞共孵育后，細胞內(nèi)TC和CE的含量無差異，且細胞膜受體SR-BⅠ的mRNA表達水平較模型組降低;而值得深思的是，對于SR-BⅠ的蛋白表達水平卻是出人意料的呈劑量依賴性降低，此結(jié)果與Fluiter等研究高脂飲食對肝實質(zhì)細胞SRBⅠ蛋白表達的影響實驗及Witt等發(fā)現(xiàn)的Vit E能降低HepG2細胞中SR-BⅠ蛋白表達結(jié)果相符，推測HepG2細胞與HDL-CE孵育時攝入了過多的脂質(zhì)，GPS對細胞進行反饋性調(diào)節(jié)而降低了SR-BⅠ基因的表達，且其調(diào)節(jié)作用主要發(fā)生在翻譯水平而不是轉(zhuǎn)錄水平，但具體機制尚有待于進一步的探索。

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