方 芳，李 珍，王烈成，祝 延，2，周 藝，柯道平，朱潔平

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽蚌埠 233000;3.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院，安徽 六安 237000;4.皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，安徽 六安 237000)

腦缺血性疾病是神經(jīng)系統(tǒng)常見病癥，其中以缺血/再灌注后導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡所引起的繼發(fā)性腦損傷危害最大，常導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙［1］。如何降低腦缺血病人的發(fā)病率，減少缺血所致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，提高病人的存活率，是目前預(yù)防腦缺血性疾病急需解決的問題。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是廣泛存在于葡萄、虎杖、花生、決明等植物性食物或藥物中的多酚類化合物，近年來的研究表明Res對人體許多重要器官，比如腎臟、腦、心臟的缺血損傷都具有保護(hù)作用［2－3］。而缺血預(yù)處理可以減少腦缺血性損傷，減少細(xì)胞的凋亡及壞死［4］。我們近期的研究證明Res預(yù)處理對腦缺血/再灌注具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用［5］，但其保護(hù)作用機(jī)制是否涉及到凋亡及其相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，目前尚未見報道。為此，我們利用TUNEL法和免疫組化法對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡及相應(yīng)凋亡蛋白進(jìn)行檢測，以期能夠?qū)es的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討，從而為臨床研發(fā)預(yù)防腦血管疾病的新藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器 白藜蘆醇，Sigma公司;兔抗鼠 Caspase-3、PI3K、p-Akt多克隆抗體均購自 Bioworld公司;細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit，POD)，Roche 公司;光學(xué)顯微鏡及其拍照分析系統(tǒng)，日本Olympus公司。

1.2 動物分組 ♂SD大鼠60只(220～250 g)，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(Sham)、缺血/再灌注組(I/R)、白藜蘆醇預(yù)處理組(Res+I/R)，每組20只。假手術(shù)組大鼠只分離血管，不留置拴線;I/R組大鼠采用栓線法阻塞右側(cè)大腦中動脈，90 min后拔出拴線給予再灌注;Res+I/R組大鼠在缺血前1 h腹腔注射Res(30 mg·kg－1)。

1.3 方法

1.3.1 局灶性腦缺血模型制備［6］采用頸內(nèi)動脈栓線法制備大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)腦缺血模型。大鼠用10%水合氯醛(300 mg·kg－1，i p)麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，輕輕剝離迷走神經(jīng)，結(jié)扎頸外動脈和頸內(nèi)動脈上的所有分支。頸總動脈切口，插入直徑為0.26 mm的MCAO栓線(購自北京沙東生物技術(shù)有限公司)，轉(zhuǎn)過頸總動脈分叉進(jìn)入頸內(nèi)動脈，然后緩緩插入，至有輕微阻力時為止(自分叉處約20 mm)，阻斷大腦中動脈的所有血供。缺血90 min后，輕輕拔出MCAO栓線，恢復(fù)血供進(jìn)行再灌注。在實驗過程中保持動物體溫(37±0.5)℃。

1.3.2 模型篩選標(biāo)準(zhǔn) 再灌注后22 h，按Bederson方法［7］進(jìn)行肢體功能的神經(jīng)缺損評分，標(biāo)準(zhǔn):0分，無任何神經(jīng)功能損失;1分，提尾左前肢屈曲內(nèi)收;2分，向左側(cè)行走;3分，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，成追尾狀。只有評分在1分以上，且取腦時腦底無凝血塊，動脈環(huán)無血栓形成，排除蛛網(wǎng)膜下腔出血和繼發(fā)性血栓形成的大鼠才可被選入繼后的實驗組。I/R組和Res組共40只動物，其中2只因麻醉意外死亡，3只線栓推進(jìn)失敗，實際觀察35只，出現(xiàn)上述神經(jīng)病學(xué)癥狀31只，成功率為88.57%。

1.3.3 TTC染色測定梗死范圍 按照朱東亞報道的方法測定梗死范圍［8］。再灌注后24 h，動物斷頭取腦，去嗅球、小腦和腦干，用生理鹽水沖洗大腦表面血污，吸干，–20℃冷凍5～10 min使之變硬，沿冠狀面切成1.5 mm厚的腦片，置于2%的TTC染液中37℃染色30 min。正常組織呈鮮紅色，梗死組織呈灰白色。將顯色后的腦切片置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，細(xì)心將梗死區(qū)挖下，稱重，以梗死組織的重量占缺血側(cè)腦重量的百分比作為相對梗死范圍。

1.3.4 原位細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL法)在缺血/再灌注后第5天，用10%水合氯醛(300 mg·kg－1，i p)麻醉后，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定至大鼠四肢僵硬，取出缺血側(cè)大腦放入相應(yīng)固定液中于4℃冰箱中固定過夜。截取視交叉至大腦橫裂的部分，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚 4 μm。按TUNEL檢測試劑盒進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件，計數(shù)400倍視野下缺血側(cè)海馬CA1區(qū)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)，每個標(biāo)本取4張切片，每張切片海馬CA1區(qū)選5個不重疊的高倍視野，取平均值。

1.3.5 免疫組織化學(xué)檢測 PI3K、p-Akt，Caspase-3的表達(dá)每只動物取上述石蠟標(biāo)本連續(xù)切片各3張，采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(SP)法進(jìn)行免疫組化染色和DAB顯色法顯色。每張切片在400倍視野下隨機(jī)選取缺血側(cè)海馬CA1區(qū)5個不重疊的高倍視野，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對結(jié)果進(jìn)行定量分析，測定平均光密度值(OD)。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇預(yù)處理降低腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能評分及減少腦梗死體積 I/R組大鼠神經(jīng)學(xué)評分平均為2.6±0.13，明顯高于Sham組評分(P＜0.05)，而缺血前1 h進(jìn)行Res預(yù)處理可明顯改善腦缺血大鼠的神經(jīng)行為學(xué)障礙(P＜0.05)，見Fig 1A。TTC染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腦組織全部染成紅色，未發(fā)現(xiàn)梗死灶。I/R組大鼠缺血側(cè)梗死范圍為(37.2±3.8)%，而缺血前1 h進(jìn)行Res預(yù)處理的Res+I/R組大鼠缺血側(cè)梗死范圍為(16.3±2.6)%，與I/R組大鼠缺血側(cè)梗死范圍相比明顯減少(P ＜0.05)，見 Fig 1B。

Fig 1 Effects of resveratrol pretreatment on neurological score and infarction volume

2.2 白藜蘆醇預(yù)處理明顯減少了海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡 經(jīng)TUNEL染色和蘇木精復(fù)染后大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞以細(xì)胞核染成棕黃色為主。在Sham組，海馬CA1區(qū)偶見TUNEL陽性細(xì)胞，表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)。與Sham組比較，I/R組海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P＜0.01);而缺血前1 h進(jìn)行Res預(yù)處理，可以明顯減少凋亡細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05)，見 Fig 2A，2B。

Fig 2 Resveratrol protects neurons from focal cerebral ischemia-induced apoptosis(TUNEL staining×400)

2.3 白藜蘆醇預(yù)處理對大鼠海馬CA1區(qū)PI3K、p-Akt表達(dá)的影響 各組大鼠海馬CA1區(qū)免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，PI3K、p-Akt蛋白的陽性細(xì)胞染色均以胞質(zhì)有棕黃色物質(zhì)沉積為主，并可顯示細(xì)胞輪廓。結(jié)果顯示Sham組大鼠海馬CA1區(qū)可見較多呈點狀分布的p-Akt陽性細(xì)胞，幾乎無PI3K陽性細(xì)胞。與Sham組比較，I/R組海馬CA1區(qū)PI3K陽性細(xì)胞差異沒有顯著性(P＞0.05)，但p-Akt陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.05)，見Fig 3。而缺血前1 h進(jìn)行Res預(yù)處理的Res+I/R組大鼠，海馬CA1區(qū)PI3K及p-Akt表達(dá)均明顯增多(P＜0.05)，見Fig 3和Tab 1。說明Res通過誘導(dǎo)PI3K的表達(dá)增高進(jìn)一步誘導(dǎo)下游p-Akt水平的增高。

Tab 1 Expressions of PI3K and p-Akt proteins in hippocampal CA1 region(±s，n=8)

Tab 1 Expressions of PI3K and p-Akt proteins in hippocampal CA1 region(±s，n=8)

*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs I/R group

Group PI3K(OD)p-Akt(OD)Sham 0.167 ±0.036 0.354 ±0.056 I/R 0.161 ±0.038 0.207 ±0.055*Res+I/R 0.289 ±0.043# 0.245 ±0.045#

2.4 白藜蘆醇預(yù)處理對大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Sham組大鼠海馬CA1區(qū)僅見極少數(shù)Caspase-3蛋白的陽性染色胞質(zhì);腦缺血/再灌注后第5天，與Sham組比較，I/R組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，見Fig 4和Tab 2，染色呈棕黃或深褐色;而在缺血前1 h進(jìn)行Res預(yù)處理的Res+I/R組大鼠，海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，見Fig 4和 Tab 2。

Tab 2 Expression of Caspase-3 protein in hippocampal CA1 region(±s，n=8)

Tab 2 Expression of Caspase-3 protein in hippocampal CA1 region(±s，n=8)

*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs I/R group

Group Caspase-3(OD)Sham 0.256 ±0.0923 I/R 0.552 ±0.0958*Res+I/R 0.341 ±0.0765#

3 討論

Fig 3 PI3K and p-Akt positive cells in hippocampal CA1 region shown by immunohistochemical assay(×400)

腦缺血/再灌注損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，如出現(xiàn)大量的氧自由基、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、能量障礙、興奮性氨基酸釋放增加等［9］，這些環(huán)節(jié)都可通過啟動凋亡相關(guān)基因、誘導(dǎo)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡或壞死［10］。海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)之一，海馬CA1區(qū)對缺氧缺血特別敏感［11］。和以往的研究一致，我們的實驗結(jié)果也表明，局灶性腦缺血/再灌注導(dǎo)致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)大面積凋亡。近年來的研究表明Res能夠通過多種機(jī)制對缺血性損傷發(fā)揮保護(hù)作用，包括抗氧化、清除自由基、抗凋亡等［12］。但Res具體是通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制對腦缺血/再灌注導(dǎo)致的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡發(fā)揮保護(hù)作用的，目前還鮮有這方面的報道。

Fig 4 Caspase-3 positive cells in hippocampal CA1 region shown by immunohistochemical assay(×400)

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它是磷酸化肌醇磷脂3位羥基的激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)下游靶分子最重要的效應(yīng)介質(zhì)。Akt的活化直接或間接影響多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和促凋亡蛋白活性，增強(qiáng)抗凋亡基因的表達(dá)和抑制細(xì)胞凋亡蛋白活性，參與生長、發(fā)育、分化和細(xì)胞的存活［13］。Noshita等［14］應(yīng)用熒光雙染技術(shù)顯示腦缺血后Akt陽性細(xì)胞不是凋亡細(xì)胞，指出PI3K/Akt信號活化可以促進(jìn)細(xì)胞存活減少凋亡。Lesne等［15］發(fā)現(xiàn)，腦缺血早期給予外源性營養(yǎng)因子可減少缺血腦組織的損傷，與提高缺血周圍區(qū)Akt的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與I/R組相比，Res預(yù)處理使腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少、PI3K和p-Akt數(shù)量明顯增多，這和以往的研究結(jié)果是一致的，并提示Res有類似于外源性營養(yǎng)因子的作用，通過激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮細(xì)胞存活和對抗凋亡的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3參與了腦缺血后神經(jīng)元損傷的病理過程，它的激活是凋亡的關(guān)鍵步驟，是凋亡的最終執(zhí)行者［16］?；罨蟮腃aspase-3可以切割許多蛋白質(zhì)底物，使細(xì)胞內(nèi)一些參與DNA修復(fù)、mRNA剪切和DNA復(fù)制的蛋白失活，從而使細(xì)胞喪失修復(fù)功能，穩(wěn)態(tài)不能正常進(jìn)行。而活化的Akt通過磷酸化作用，可以抑制下游效應(yīng)分子Caspase-3的活性，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和分化等作用［17］。West等［18］發(fā)現(xiàn) Res預(yù)處理通過減少Caspase-3的激活，對新生兒缺氧缺血性腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用。我們實驗中也發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血導(dǎo)致海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)明顯增加，Res預(yù)處理使缺血大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)明顯降低，這和以往的實驗結(jié)果是一致的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Res預(yù)處理對局灶性腦缺血/再灌注導(dǎo)致的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡具有保護(hù)作用。其主要作用機(jī)制可能是通過激活PI3K-Akt信號通路，使p-Akt的水平增加，進(jìn)而抑制下游效應(yīng)分子Caspase-3蛋白的激活來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的，但具體的機(jī)制亟待進(jìn)行更深入的研究。

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