蘆 蕾，王 泉，李 廣,3，高金珊

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 大豆分子設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130102；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

0 引 言

微管是高度保守的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，由13根α-β微管蛋白組成，直徑約為25 nm[1-2]。微管聚合物的延伸端(Plus end)通常是β-微管蛋白，負(fù)端(Minus end)是α-微管蛋白[3]。微管蛋白主要以α-β相互作用連接，但是也存在著α-α和β-β相互作用，連接的地方被稱為接縫(Seam)，是微管最薄弱的地方。微管接縫開裂會(huì)導(dǎo)致微管的解聚[4-5]。α-微管蛋白高度保守，而β-微管蛋白的C端相對(duì)不保守，這就使β-微管蛋白在環(huán)境改變時(shí)可以通過末端修飾實(shí)現(xiàn)微管延伸并維持穩(wěn)定[6]。微管始終處于解聚-成核的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，13個(gè)γ-微管和多個(gè)微管復(fù)雜蛋白組成的環(huán)狀蛋白復(fù)合體(γ-TuRC)保障了內(nèi)環(huán)境下微管的成核速率[7-8]。

植物微管在維持細(xì)胞形態(tài)[9-10]、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[11]、細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸[12-13]、細(xì)胞分裂和細(xì)胞壁形成[14]等過程中發(fā)揮重要作用。在有絲分裂早期，微管圍繞著細(xì)胞核形成一個(gè)早期的前帶結(jié)構(gòu)，它能夠決定細(xì)胞板的位置；并且這種微管早期前帶結(jié)構(gòu)能夠通過限制紡錘體的旋轉(zhuǎn)決定細(xì)胞分離的準(zhǔn)確性，從而調(diào)控植物細(xì)胞分裂[15]。在擬南芥中，微管相關(guān)蛋白WDL4能夠通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的分布來調(diào)節(jié)頂端的發(fā)育，介導(dǎo)植物細(xì)胞差異生長(zhǎng)[16]。微管作為細(xì)胞骨架的重要組分，可以調(diào)控植物細(xì)胞壁纖維素的合成與沉積[17-18]，為胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸提供快速精確的運(yùn)輸軌道[19-20]，同時(shí)能夠響應(yīng)和傳遞環(huán)境信號(hào)，在植物發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答過程中具有重要調(diào)控作用[21-23]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥微管切割蛋白ATKTN1對(duì)調(diào)控鹽脅迫下擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[24]。擬南芥微管切割蛋白ktn1-4突變體在鹽脅迫的早期耐鹽性增加，但在后期耐鹽性顯著下降，鹽脅迫導(dǎo)致擬南芥ktn1-4突變體微管組織的異常解聚和重組[24]。還有研究表明，煙草α-微管蛋白功能缺失造成相應(yīng)突變體微管運(yùn)動(dòng)緩慢，煙草花葉病毒的細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)活性也受到抑制[25]。植物中存在的芳香族物質(zhì)，香味能夠吸引害蟲的入侵，微管為這些香味物質(zhì)的傳輸及擴(kuò)散提供了軌道，因此，微管組織也為防治蟲害、研發(fā)新型抗蟲劑提供了新思路[26]。因此，微管可以通過改變組織結(jié)構(gòu)修正外界因素改變導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)偏差，提高植物適應(yīng)外界環(huán)境變化的能力[27-28]，對(duì)提升植物的耐受能力具有重要作用。

豆科植物作為重要的糧、油、牧作物，在人類生產(chǎn)和生活中具有重要地位。隨著我國(guó)人民生活水平的提高，對(duì)大豆等豆科植物的需求也急劇增加[29]。然而，鹽堿脅迫、干旱脅迫、病原菌入侵等外界不利生長(zhǎng)環(huán)境抑制了豆科植物的生長(zhǎng)發(fā)育，也對(duì)豆科植物的產(chǎn)量和生物量產(chǎn)生了極大的影響。深入研究微管的功能，解析微管基因在大豆植物應(yīng)答外界環(huán)境脅迫中的作用機(jī)制，可以為通過改良微管基因增加豆科植物逆境耐受性提供科學(xué)依據(jù)。

1 豆科微管對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)

植物非生物脅迫耐受機(jī)制能夠調(diào)控植物適應(yīng)環(huán)境因素帶來的負(fù)面影響，從而對(duì)作物產(chǎn)量、生態(tài)環(huán)境平衡和生物多樣性具有重要作用[30-31]。非生物脅迫通常指干旱、鹽脅迫、寒冷和內(nèi)澇等[32-33]。目前對(duì)豆科植物非生物脅迫耐受性機(jī)制的研究主要集中在脅迫條件下抗性基因的表達(dá)變化[34-35]、膜組成成分的改變[36-37]以及脅迫相關(guān)酶活性的變化[38-40]等方面。

干旱脅迫是導(dǎo)致作物減產(chǎn)的主要因素，會(huì)造成嚴(yán)重的發(fā)育阻滯和生理損傷[41-43]。研究表明，豆科微管參與調(diào)節(jié)氣孔形態(tài)、細(xì)胞壁構(gòu)建和脫落酸(ABA)的積累；在干旱脅迫下，大豆β-微管蛋白表達(dá)量下調(diào)，微管蛋白調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉減少水分蒸發(fā)[44]。Faria等[45]將苜蓿幼苗胚根進(jìn)行聚乙二醇(PEG)處理模擬干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)PEG處理會(huì)導(dǎo)致微管組織解聚，復(fù)水后微管陣列重建，細(xì)胞恢復(fù)完整性。

鎘(Cd)是一種非必需的重金屬，在土壤-植物系統(tǒng)中具有相對(duì)較高的移動(dòng)性和干擾植物代謝的能力，每年約有25 000 t鎘釋放到環(huán)境中[46-48]。研究發(fā)現(xiàn)，Cd處理的大豆幼苗根系生長(zhǎng)受到明顯抑制，降低有絲分裂活性，導(dǎo)致大豆微管陣列結(jié)構(gòu)紊亂甚至完全解聚[47]。重金屬污染導(dǎo)致不同亞型微管蛋白乙?；屠野彼峄乃皆黾?，使得微管的穩(wěn)定性增強(qiáng)，這對(duì)植物細(xì)胞維持穩(wěn)定具有重要調(diào)節(jié)作用。在豌豆中就有研究發(fā)現(xiàn)，Cd會(huì)導(dǎo)致豌豆微管的高度敏感性，引起細(xì)胞分裂紊亂，細(xì)胞周期改變[49]。

重金屬鎢(W)能夠被動(dòng)物和植物大量吸收，鎢污染的農(nóng)作物進(jìn)入到食品供應(yīng)鏈會(huì)對(duì)生物體造成傷害，如引發(fā)兒童白血病[50]。鎢處理的豌豆根尖細(xì)胞微管蛋白變少，陣列排布混亂，加入與鎢相互拮抗的鉬后，微管陣列恢復(fù)[50]，表明鎢可能打破了微管蛋白之間的平衡，影響了豌豆微管陣列的排布。以上研究結(jié)果表明，植物遭受重金屬污染后，微管通過動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)自身排列以適應(yīng)環(huán)境改變保障細(xì)胞穩(wěn)定性。

研究發(fā)現(xiàn)，在暗條件下生長(zhǎng)的大豆幼苗下胚軸能夠快速伸長(zhǎng)，節(jié)間發(fā)育迅速，這是由于大豆的周質(zhì)微管可以調(diào)控纖維素的合成速度，微管直接或間接作用于纖維素合酶復(fù)合物進(jìn)而影響節(jié)間發(fā)育，控制形態(tài)的建成[51]。此外，大豆幼苗中β-微管蛋白水平和節(jié)間伸長(zhǎng)率呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。光照條件下，β-微管蛋白基因幾乎在所有組織器官中的表達(dá)量均處于較低水平，但是在下胚軸中的表達(dá)水平較高，是其他組織的10倍[52]。但是在黑暗誘導(dǎo)下，其他大豆微管蛋白編碼基因在大豆幼苗的下胚軸伸長(zhǎng)區(qū)發(fā)生快速轉(zhuǎn)錄，使得微管編碼基因大量表達(dá)，下胚軸迅速生長(zhǎng)[53]。

2 豆科微管蛋白參與病原菌入侵調(diào)節(jié)

大豆胞囊線蟲病(Soybean cyst nematode，SCN)是一種世界性大豆病害，每年可導(dǎo)致大豆產(chǎn)量損失20%～30%，病害嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)高達(dá)80%甚至絕產(chǎn)，帶來了不可忽視的經(jīng)濟(jì)損失[54-56]。它可以破壞大豆內(nèi)層細(xì)胞，使細(xì)胞脹大破碎，細(xì)胞壁溶解，溶解后的細(xì)胞質(zhì)合并形成合胞體。Klink等[57]發(fā)現(xiàn)，在大豆胞囊線蟲形成的大豆合胞體細(xì)胞中α-微管蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于遠(yuǎn)離感染部位的根細(xì)胞，染色體微管陣列在大豆胞囊線蟲侵染后呈現(xiàn)出較強(qiáng)的微管陣列解聚信號(hào)。雖然大豆胞囊線蟲的入侵導(dǎo)致微管陣列在合胞體中發(fā)生了顯著變化，但是尚未在這些合胞體細(xì)胞中觀察到典型的微管陣列[58]。

通過共生體系進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，真菌的入侵導(dǎo)致根部皮層細(xì)胞微管重組，最終改變根部細(xì)胞組織和形態(tài)。皮層細(xì)胞在真菌進(jìn)入前開始對(duì)其細(xì)胞骨架進(jìn)行修飾，并在真菌穿透細(xì)胞前與共生體之間進(jìn)行信號(hào)交換[59-62]。因此，我們猜測(cè)微管很可能參了菌根共生關(guān)系的信號(hào)調(diào)節(jié)或宿主細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控。

Blancaflor等[62]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿被真菌侵染后，微管組織在菌絲發(fā)育的各個(gè)階段都發(fā)生了顯著變化。當(dāng)菌絲進(jìn)入皮層細(xì)胞時(shí)，一些微管會(huì)重新定向，使得菌絲穿透皮層細(xì)胞繁殖，菌絲分支侵染細(xì)胞面積增大時(shí)，微管能夠形成厚而強(qiáng)的熒光聚集體，在生長(zhǎng)的菌絲分支之間形成連接；隨著菌絲繼續(xù)擴(kuò)大并占據(jù)細(xì)胞體積的大部分時(shí)，微管聚集體變少，隨之而來的是被更薄的碎裂微管鏈所取代。在建立共生的過程中微管被廣泛重組，菌絲周圍密集的微管陣列可能參與了侵染后各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合到膜的過程，促進(jìn)了真菌與植物根之間的活性養(yǎng)分交換。Kitaeva等[63]將野生型植株和共生結(jié)節(jié)異常突變體的微管組織進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)微管組織形態(tài)及分布與病原菌入侵后形成的共生體的分布有關(guān)。以上研究結(jié)果說明，病原菌入侵苜蓿能夠?qū)е挛⒐荜嚵须S菌絲的分布變化而變化，病原菌與宿主植物很可能通過微管陣列進(jìn)行物質(zhì)的轉(zhuǎn)換和傳遞。

在百脈根中，細(xì)菌的侵染同樣會(huì)導(dǎo)致百脈根微管陣列發(fā)生重組，微管陣列能夠感知細(xì)菌入侵的信號(hào)并通過調(diào)節(jié)微管陣列影響細(xì)胞活性[64]。微管的這種超敏反應(yīng)能夠迅速對(duì)病原菌的入侵做出反應(yīng)以維持細(xì)胞的穩(wěn)定。

3 豆科微管蛋白調(diào)節(jié)Ca2+信號(hào)

在植物受到生物脅迫的侵害時(shí)，植物首先需要感應(yīng)到這些刺激信號(hào)，Ca2+信號(hào)是病原入侵的早期反應(yīng)信號(hào)之一。較高的Ca2+流入細(xì)胞會(huì)促使微管蛋白的解聚，而細(xì)胞內(nèi)微管的解聚或重排也會(huì)引起Ca2+大量外流。微管骨架可以調(diào)控質(zhì)膜鈣離子通道，通過其解聚和聚合的動(dòng)態(tài)變化調(diào)節(jié)胞外鈣離子內(nèi)流數(shù)量。微管系統(tǒng)損傷后，質(zhì)膜上某些蛋白激酶會(huì)失活，以Ca2+作為第二信使的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也會(huì)受到阻礙[65]。Ebel等[66]通過監(jiān)測(cè)病原菌入侵后的大豆細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)病原菌入侵后細(xì)胞內(nèi)的Ca2+離子快速流失，大豆β-微管蛋白I表達(dá)下調(diào)，微管發(fā)生大量的解聚。然而，此研究還發(fā)現(xiàn)，β-微管蛋白 II能夠在更高水平上表達(dá)，從而使微管的結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。以上研究結(jié)果表明，不同亞型的微管蛋白對(duì)Ca2+信號(hào)的差異響應(yīng)保障了細(xì)胞骨架整體的穩(wěn)定性。

因此，微管成核和解聚的動(dòng)態(tài)平衡保障了豆科植物細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、增殖分裂和外環(huán)境應(yīng)激等生理活動(dòng)，豆科植物微管對(duì)響應(yīng)外界環(huán)境條件變化和提升植物的耐受能力方面具有重要意義。

4 豆科微管蛋白相關(guān)基因

在模式植物擬南芥中，α-微管蛋白、β-微管蛋白和γ微管蛋白編碼基因已經(jīng)被成功克隆，微管蛋白結(jié)構(gòu)也被成功解析[67-69]。為了找尋豆科植物中的微管基因，作者研究團(tuán)隊(duì)利用擬南芥的相關(guān)微管蛋白，通過Phytozome(V12.1)對(duì)比篩選大豆、菜豆和苜蓿的同源蛋白，將蛋白序列通過軟件MAGA 7.0比對(duì)分析后構(gòu)建進(jìn)化樹，并進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，進(jìn)而對(duì)大豆、苜蓿和菜豆中的微管相關(guān)基因進(jìn)行了歸類。結(jié)果顯示，大豆、苜蓿和菜豆中α-微管蛋白編碼基因的數(shù)量分別為13、8、7個(gè)；β-微管蛋白編碼基因的數(shù)量分別為18、11、9個(gè)；γ-微管蛋白編碼基因的數(shù)量分別為4、6、6(表1)。

表1 三種豆科植物tubulin編碼相關(guān)基因Table 1 Tubulin genes in three legumes

大豆中編碼α/β-tubulin蛋白的基因數(shù)量明顯高于苜蓿和菜豆，而大豆中γ-微管蛋白與擬南芥相關(guān)蛋白的同源性較低(表1)。以上結(jié)果說明在豆科植物中，大豆中的α/β-微管蛋白具有更高的多態(tài)性。我們發(fā)現(xiàn)不同豆科植物的微管基因存在著較明顯的差異，深入研究豆科微管蛋白功能，對(duì)于闡明其在豆科物種中的進(jìn)化方式具有重要意義，也能為在分子水平上設(shè)計(jì)優(yōu)良的抗逆豆科品種提供基因資源。

5 展望

植物微管陣列是一個(gè)高度保守的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，微管解聚-成核的動(dòng)態(tài)平衡影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育。微管系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)發(fā)育在豆科細(xì)胞分裂、指導(dǎo)纖維素的合成與沉積、下胚軸的形態(tài)建成、胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸和對(duì)生物和非生物脅迫響應(yīng)方面發(fā)揮著重要功能。但是，微管如何響應(yīng)環(huán)境信號(hào)，特別是如何響應(yīng)光信號(hào)、生物鐘信號(hào)，在植物與微生物共生中微管的調(diào)控機(jī)理是什么，這些都是未來要解決的重要科學(xué)問題。研究豆科微管相關(guān)的基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在豆科植物微管作用中的分子機(jī)制，豆科微管陣列在細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)重排、環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)中的作用將會(huì)有助于深入了解其在應(yīng)對(duì)外界脅迫中的功能，對(duì)于培育高耐逆性的豆科植物具有重要的理論指導(dǎo)意義。