陳曉峰 叢山 王百川

摘要：對灰霉菌（Botrytis cinerea）誘導抗、感大白菜葉片α-微管蛋白基因誘導表達的特點及微管動態(tài)結構變化進行研究。結果表明，灰霉菌接種后大白菜中4種α-微管蛋白基因均具有上調表達特點，且抗病品種較感病品種誘導表達明顯。葉片細胞微管免疫熒光觀測發(fā)現(xiàn)，接種48、96 h后抗病品種較感病品種微管骨架受病原菌侵染影響較小，結構變化不明顯。研究結果說明微管在植物對抗真菌病原菌侵染中具有一定的作用。

關鍵詞：大白菜;灰霉菌;葉片細胞;微管;α-微管蛋白;互作動態(tài);結構變化;作用機制

中圖分類號：S436.341 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0124-03

微管是真核生物細胞的重要組成部分，它和微絲、中間纖維組成植物的細胞骨架結構，在細胞形態(tài)發(fā)生、信號識別、細胞極性的建立等方面起著至關重要的作用[1-3]。在植物生長發(fā)育過程中，微管蛋白還可以調節(jié)植物細胞以不同的形態(tài)來適應環(huán)境和功能需求，同時對植物纖維素和木質素合成，構建完整細胞骨架均具有重要作用[4]。植物微管蛋白主要由α-微管蛋白和β-微管蛋白基因家族組成[4-8]，其貫穿整個細胞生長發(fā)育的全過程，參與微管的生長發(fā)育和動力學變化[9-12]。

最近幾年，關于微管骨架在植物抗性研究中的作用越來越受到重視，人們對微管骨架參與植物和病原菌互作中的作用進行了廣泛研究[13-25]，發(fā)現(xiàn)通過化學物質解聚細胞微管可阻礙過敏性壞死反應（hypersensitive response，簡稱HR）發(fā)生，加劇病原菌的入侵，降低植物抗病力[13，22-23]。在病原菌和外源化學物質誘導下，α-微管基因表達也不盡相同[2，14-17，23-25]，是否該基因家族全部成員都參與了植物抗性反應目前尚不清楚。

本研究對不同抗性大白菜材料α-微管蛋白基因受病原菌誘導表達的特點進行分析，對微管骨架在寄主與病原菌互作中的動態(tài)結構變化進行觀察，以期闡明微管在抗真菌病害體系中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2016—2018年在中國農業(yè)大學煙臺研究院進行。大白菜抗真菌病害品種為新煙雜3號（XYZ），感病品種為包頭蓮（BTL）。大白菜種子經消毒后，于人工氣候箱在20～25 ℃、光周期12 h/d、相對濕度（85±5）%條件下培養(yǎng)，待幼苗長至2～4張真葉時用于試驗。

免疫熒光觀測所用果膠酶和纖維素酶，微管標記抗體一抗為抗α-微管蛋白IgG，二抗為FITC結合的羊抗鼠IgG，均采用Sigma公司產品。

1.2 灰霉菌接種液的制備和接種程序

灰霉菌（Botrytis cinerea）接種液的制備和接種參照馬清華等的方法[26-27]，最終配成的孢子懸浮接種液濃度為1×106個/mL。處理組每個單株葉片噴灑病原菌誘導液，對照組用純水代替病原菌誘導液。誘導處理后植株在100%相對濕度下保濕24 h，然后揭掉遮光物，于人工氣候箱在20～25 ℃、光周期12 h/d、相對濕度（85±5）%條件下培養(yǎng)，直至采樣結束，每個處理設3個重復。

1.3 實時定量PCR檢測灰霉菌誘導α-微管蛋白基因表達

1.3.1 實時定量PCR反應引物設計 在GenBank大白菜數據庫中選取所需要的α-微管蛋白基因，引物設計參考Zhang等的研究[2]，大白菜actin基因為內標基因，用于實時定量PCR的反應引物序列見表1。

1.3.2 實時定量PCR反應體系和反應程序 采用Takara公司SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行實時定量PCR反應。提取處理和對照葉片0、12、24、36、48、72、96 h的大白菜葉片RNA，利用反轉錄酶將mRNA合成cDNA。實時定量PCR反應體系和反應程序參考陳曉峰等的方法[28]，每個處理設3次重復。

1.4 大白菜葉片細胞微管間接免疫熒光檢測

分別采集灰霉菌誘導接種0、48、96 h抗感病大白菜植株葉片，參考張靜宜等的方法[3]進行微管免疫熒光觀測。

2 結果與分析

2.1 灰霉菌誘導α-微管蛋白基因表達分析

由圖1可知，4個α-微管蛋白基因均呈現(xiàn)誘導表達特點，但表達特點各不相同。4個基因在抗病品種中的表達均高于感病品種，其中Bra006517和Bra002260基因呈現(xiàn)單峰表達特點，Bra014232基因在所有試驗材料中呈現(xiàn)雙峰表達特點。4個α-微管蛋白基因均在誘導24～48 h內出現(xiàn)峰值表達量，其中Bra014232基因表現(xiàn)出明顯的誘導表達特點，Bra002260、Bra006517、Bra039648呈現(xiàn)較弱的上調表達特點。感病品種中4個基因在誘導48 h后表達量明顯下降。

2.2 間接免疫熒光觀測大白菜葉片微管結構差異

由圖2可知，灰霉菌誘導處理后，抗、感病品種葉片中微管顯微結構觀測結果表現(xiàn)出明顯的差異，在整個誘導過程中，抗病品種XYZ的葉片細胞中細胞核周圍微管骨架結構變化不明顯，部分細胞微管在病原菌誘導96 h后結構出現(xiàn)不完整現(xiàn)象。感病品種BTL葉片細胞在病原菌誘導48 h后微管骨架結構出現(xiàn)分散現(xiàn)象，病原菌誘導96 h后，絕大部分微管結構出現(xiàn)分散降解現(xiàn)象。

3 結論與討論

微管蛋白由于在保持細胞結構、胞內物質運輸、細胞發(fā)育等過程中具有重要作用，人們對其在植物抗病體系中的作用進行了廣泛研究。關于微管骨架與植物抗病性關系研究主要集中在病原菌與寄主過敏性壞死反應和抗性化學物質累積等方面[9]。研究發(fā)現(xiàn)，通過oryzalin等已知的誘導微管解聚的化學物質處理植物材料，這些植物對外源病原菌侵染誘導過敏反應細胞的產生率降低，抗性降低[9，16，23]。正常條件下植物微管呈網狀結構圍繞在細胞周圍，病原菌侵染植物組織后，免疫熒光觀測發(fā)現(xiàn)微管骨架分散聚集于侵染點或接種點周圍[14-18]，說明微管直接或者間接參與了植物的抗性反應。

本研究對大白菜中4種α-微管蛋白基因進行了誘導表達分析，這4個基因在大白菜不同組織中存在特異表達的特點，且受茉莉酸甲酯（MJ）、紫杉醇、赤霉素（GA3）等化學物質誘導[2]。本研究中筆者所在課題組發(fā)現(xiàn)4個α-微管蛋白基因均受灰霉菌誘導，呈上調表達特點，且抗病品種中微管蛋白基因表達量略高于感病品種，個別基因在抗病品種中出現(xiàn)雙峰表達特點，這都說明微管蛋白基因在抗病品種中參與了大白菜對真菌病原菌侵染的抗性反應。對不同抗性材料葉片細胞中微管骨架的免疫熒動態(tài)觀測發(fā)現(xiàn)，抗病品種葉片細胞中微管骨架結構比較完整，只有少量細胞出現(xiàn)微管降解現(xiàn)象，而感病品種在誘導處理2 d后微管骨架結構出現(xiàn)分散降解，微管降解導致植物細胞結構變化，說明微管骨架結構完整對真菌病原菌與寄主抗性反應的重要性。

未來須要著重研究整個微管基因家族組織和誘導表達特性，同時完善病原菌誘導植物細胞微管骨架的動態(tài)研究。

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